Принципы работы спектрофотометрических сенсоров

Спектрофотометрический метод выявления присутствия и измерения концентрации биологически важных веществ давно известен и широко применяется на практике. Он основан на том, что большинство веществ имеют свои специфические спектры излучения и поглощения в той или иной области спектра. Поэтому при прохождении света сквозь вещество его спектральный состав изменяется. По этим изменениям можно выявить присутствие контролируемого вещества (аналита) (это качественный спектральный анализ), а измеряя величину изменений спектральных интенсивностей, – вычислить концентрацию аналита или его количество (это количественный спектральный анализ – спектрофотометрия).

В технике спектрофотометрические измерения производят обычно на плоскопараллельных прозрачных твердых пластинах, на тонких плоскопараллельных пленках, содержащих аналит, или на прозрачных растворах, залитых в плоскопараллельные кюветы калиброванной (точно заданной) толщины.

Известно много разновидностей (методов, методик) спектрофотометрии. Если измерения осуществляют с использованием одной кюветы с раствором (или одной пластины, пленки), то это – одноканальная спектрофотометрия. Если используют несколько кювет (пластин, пленок) разной толщины или с разной концентрацией аналита и сравнивают интенсивности прошедших сквозь них нескольких пучков света, то это – многоканальная спектрофотометрия.

Если спектральные интенсивности измеряют лишь на одной длине волны, то такой метод называют одноволновым, если на двух длинах волн, то – двухволновым, если на многих длинах волн, то – многоволновым. Может записываться также непрерывный спектр прошедшего сквозь исследуемые образцы излучения. Тогда для получения результатов анализа используют всё распределение спектральных интенсивностей в выделенной области спектра (метод непрерывного спектра).

В зависимости от области спектра, в которой выполняются спектрофотометрические исследования, говорят об инфракрасной, видимой, ультрафиолетовой спектрофотометрии.

Напомним вкратце законы поглощения и рассеяния света. Основной закон ослабления света при прохождении сквозь вещество в дифференциальной форме имеет вид:

где – интенсивность света в веществе на глубине , – прирост интенсивности света после прохождения очень тонкого слоя вещества толщиной , – коэффициент ослабления света в веществе. Знак минус означает, что при прохождении света сквозь вещество его интенсивность убывает. Ослабление света может происходить как за счет поглощения, так и за счет рассеяния света веществом. Коэффициент ослабления света веществом в общем случае зависит от длины волны света .

Если проинтегрировать дифференциальное выражение (18.1) по толщине слоя вещества от 0 до , принимая, что на входе в слой (при ) интенсивность света равна , то получим интегральный закон прохождения света через слой вещества:

Отношение интенсивности света после прохождения слоя вещества к интенсивности падающего на него света

называют пропусканием света. Тогда интегральный закон прохождения света через слой вещества записывают в виде:

Часто пользуются также понятием оптической плотности слоя вещества

Тогда интегральный закон прохождения света через слой вещества записывают в виде:

При работе с пластинами, тонкими пленками, кюветами с раствором (рис. 18.1) приходится учитывать также отражение света от их передней и задней граней.

Рис. 18.1. Типичная оптическая схема спектрофотометрии "на пропускание" света

Тогда интенсивность света, прошедшего сквозь исследуемый образец, описывается известной формулой

где – коэффициент пропускания кюветы (пластины, тонкой пленки), учитывающий только отражение света на гранях. Иногда в него включают также "фоновое" поглощение чистого растворителя (вещества пластины, пленки) в отсутствие аналита. В оптике аналит часто называют также "красителем", поскольку он придает или меняет окраску раствора. В этом случае коэффициент пропускания показывает, какая доля падающего света проходит сквозь кювету с чистым растворителем (сквозь пластинку, плёнку и т.д.) при отсутствии аналита.

Если мы имеем раствор лишь одного вида молекул (одного "красителя") в прозрачном растворителе, то

где – молярный коэффициент поглощения красителя; – его молярная концентрация.

Измеряя спектральные интенсивности и в полосе поглощения красителя и зная пропускание кюветы , значения и , по формулам (18.7, 18.8) можно вычислить концентрацию красителя.

Если мы имеем раствор нескольких разных красителей в растворителе, который и сам частично поглощает свет, то

где – молярные коэффициенты поглощения вещества-растворителя и 1-го, 2-го, ... , -го красителей соответственно; – их молярные концентрации.

Свет при прохождении сквозь вещество может ослабляться не только из-за поглощения, но и из-за рассеяния. Тогда в формулах (18.2) появляются аналогичные слагаемые, обусловленные рассеянием света.