Субстрат – отходы целлюлозной и деревообрабатывающей промышленности. Такое измельченное сырье содержит большое количество целлюлозы, гемицеллюлозы, пектинов, затем его подвергают кислотному гидролизу. Ок. 65% полисахаридов гидролизуется до мономеров. Такой гидролизат отделяют от смеси, нейтрализуют кислоту и подают в ферментер. В качестве посевного материала используются дрожжи рода Candida и Saccaromycetas. Цикл ферментации составляет ок. 20 часов. Из 1 т отходов получается ок. 200 кг дрожжей. Клетки отделяют и упаривают до остаточной влажности 8-10%.
При использовании молочной сыворотки – из 1 т. сыворотки получают 10 кг дрожжей и 50 кг лактозы. При выращивании на молочной сыворотке специальных рас дрожжей можно получить 3 вида продуктов:
Заменитель цельного молока для выращивания молодняка;
Жидких белков продуцируется в 2 раза больше чем сыворотки (прамикс);
Для получения БОО используются сине-зеленые водоросли, спирулина.
Получение препаратов нормофлоры.
Существует понятие нормальной микрофлоры – обнаруживается практически здоровых организмов. Наиболее интересным явл. характеристика нормофлоры толстой кишки. В организме здорового человека содержится 2-3 кг бактерий в толстой кишке. Препараты, которые используются как альтернатива антибиотиков и способствуют поддержанию нормальной численности м/о называются - пробиотками. Это живые клетки м/о и их комплексы, структурные компоненты и метаболиты м/о. также продукты функционального питания различного происхождения, которые способны поддерживать и обеспечивать выживание нормофлоры в организме человека.
Функциональное питание – научно практическое направление, которое возникло на стыке биотехнологии, пищевой промышленности и медицины. Оно предполагает использование таких продуктов питания, которые при ежедневном потреблении оказывают регулирующее действие на организм в целом или его отдельные органы.
Требования к пробиотикам:
1. Они не должны оказывать отрицательное действие на микрофлору ЖКТ;
2. Должны обладать выраженным клиническим действием и могут использоваться при долечивании ряда заболеваний – аллергий, язвенного колита и
3. Пробиотики должны способствовать повышению иммунного статуса организма, регулировать пищеварение.
В настоящее время пробиотики как биотехнологический продукт делятся на несколько типов:
1. Монокомпонентные – бифидумбактерин (Biphidum), бифилиз (Biphidum + органические кислоты, лизоцим). Они выпускаются в виде таблеток или суспензий. Используются при ОКИ, особенно вирусной этиологии.
2. Поликомпонентные – Линекс (ассоциация из Biphidum, Lactobacter, Enterococcus). Помимо выраженного профилактического действия он поддерживает физиологическое состояние толстого кишечника. Биоспорин (Bacillus), Бифолак (Biphidum, Lactobacter).
3. Комбинированные – несколько видов бактерий и др. БАВ – аципол (Acydophillus + органические кислоты).
Получение.
1. Подготовка и стерилизация питательной среды. Готовят маточную культуру. Может занимать до 10 сут.
2. Промышленное выращивание культуры (18-20 ч.), t 370 С. Добиваются плотности клеток 109 в 1 мл культуры.
3. Клетки отделяют и помещают в среду для высушивания (среда готовится из обезжиренного молока или сахаро-желатиновая). В такой среде разливается по ампулам, высушиваются мезофильно (-400С), ампулы запаивают. Наклеивается этикетка с указанием названия препарата, № партии, количество активных клеток в препарате, завод изготовитель, срок годности.
Для каждой партии проводится контроль качества: бактериальная чистота препарата (определяемой содержание сапротрофов должно быть не более 300 клеток на заданный объем препарата, должны отсутствовать патогенные и условно патогенные м/о). оценивается безвредность препарат, бактериальная активность препарата (жизнеспособность и активность кислотообразования).
Кроме пробиотиков для стимуляции роста нормофлоры используются пребиотики – пищевые добавки, которые стимулируют рост нормофлоры. Это природные или синтетические низкомолекулярные углеводы, которые не гидролизуются ферментами ЖКТ (т. е. до толстого кишечника доходят в неизменном виде).
Синтетические – лактулоза (лактоза + фруктоза). Она стимулирует рост бифидо- и лактобактерий. - парааминобензойная кислота, Са соль пантотеновой кислоты.
Природные – инулин – полимер фруктозы, в достаточно высокой концентрации содержится в одуванчиках, георгине.
Комплексные – симбиотики – смесь пробиотиков и пребиотиков.
Основы инженерной энзимологии.
ИЭ – использование иммобилизированных клеток и ферментов (закрепленных).
Основная задача – это разработка биотехнологических процессов в которых используются каталитически действующие ферменты, выделяемые из биологических систем или находящиеся внутри клеток, лишенных способности к росту.
Эффективность разработок по ИЭ определяется:
Выбором объекта;
Выбором носителя для иммобилизации;
Способом связывания объекта и носителя.
Преимущества использования иммобилизированных объектов:
Удержание объекта в объеме реактора;
Высокая активность процесса;
Возможность контроля за м/о объекта;
Возможность быстрого и полного отделения биотехнологического продукта;
Возможность организации непрерывного процесса с многократным использованием биологического объекта.
Иммобилизированные клетки и ферменты используются для:
1. Получение органических кислот и аминокислот;
2. Получение глюкозо-фруктозных сиропов;
3. Биологическая трансформация в-в;
4. Использование в качестве биосенсоров – это устройства в которых чувствительный слой содержит биологический материал, реагирующий на присутствие определенного компонента и генерирующие электрический сигнал, связанный с концентрацией и наличием этого в-ва. Биологическим материалом м. б ферменты, ткани, бактериальные клетки, антиген, антитела, отдельные органеллы клеток, рецепторы организмов ДНК. 1-е биосенсорное устройство – глюкометр, 2-е – использование иммобилизированного фермента уреазы в аппарате искусственная почка. Иммобилизированные клетки часто явл. тромболитическими ферментами.
Иммобилизированные клетки используются для осуществления процессов биотрансформации или биосинтеза. На протяжении нескольких месяцев или лет. Первый опыт был проведен более 100 лет назад – это было получение уксуса бактериями, иммобилизированными на буковой стружке. Наиболее активно в 70-е гг. ХХ в. Иммобилизированными м. б. м/о различных таксономических гр., животных клеток, споры частично поврежденных клеток (замороженные/оттаявшие), мертвые клетки (ацетоновые тела).
Иммобилизированные клетки имеют ряд преимуществ перед свободноживущими или иммобилизированными ферментами:
1. Отсутствие затрат на выделение ферментов;
2. Отсутствие или снижение затрат на выделение и очистку продуктов реакции;
3. В клетках наблюдается более высокая ферментативная активность и более высокая стабильность ферментов;
4. Отмечается возможность создания полунепрерывных и непрерывных автоматизированных процессов;
5. В клетках м. б. длительная регенерация Ко-фактора (восстановление НАД•Н2, НАДФ•Н2).
Иммобилизированные ферменты:
В 1916 г. было показано, что фермент инвертаза (сахароза) сохраняет свою активность при иммобилизации на алюмосиликатах или угле.
В 1939 г. был получен патент на способ обработки шкур животных протеолитическими ферментами, адсорбированными на древесном угле.
Иммобилизированные ферменты активно используются с середины 70-х гг.
Преимущества:
1. ИФ легко отделить от реакционной смеси. В результате можно быстро остановить реакцию, получить продукты не загрязненные ферментами, а ферменты использовать повторно.
2. Можно проводить процесс непрерывно. Скорость реакции регулируется за счет подкисления субстрата.
3. МФ позволяют целенаправленно изменять его свойства и специфичность за счет изменения факторов внешней среды рН, t и др.
Идеальный материал для иммобилизации должен соответствовать следующим требованиям:
Низкая стоимость.
Обладать высокой биологической и химической стойкостью.
Должны быть гидрофильными.
Должен легко активироваться.
Должен отличаться возможностью и способностью придания ему различных функций (мембраны гранул).
По химической природе:
Неорганические;
Органические (природного и синтетического происхождения).
Методы иммобилизации:
1. Химические – м/у носителем и объектом осуществляют ковалентную связь.
2. Физические – адсорбция, включение в гели, инкапсуляция, использование липосом.
Включение в гели и микрокапсулы – биологический объект включается в 3-х мерную структуру геля. Гель м. б. природного происхождения (агар, желатин); синтетического (полиакриламидный гель, поливиниловый спирт).
2 подхода создания 3-х мерных структур с биологическим объектов внутри:
1. Биологический объект вносится в водный раствор мономера, который затем полимеризуют.
2. Биологический объект вносится в раствор готового полимера, который переводится в гелеобразное состояние.
Способ иммобилизации включением в гели – самый простой и эффективный.
Инкапсулирование – предполагает, что биологический объект включается в полупроницаемую мембрану, которая проницаема для субстрата реакции и могут удаляться продукты реакции.
Использование липосом – с 80-х гг. – это сферические образования, которые окружены липидным слоем. Размеры таких гранул от 10 нм.
Липосомы используются для целенаправленного достижения лекарственных препаратов, БАВ, ферментов.
Их получают:
Липид (лицетин) упаривают до получения тонкой пленки на внутренней поверхности сосуда, туда вносят раствор ферментов или др. в-ва и интенсивно встряхиваются. В результате образуются липосомы.
После поступления в организм липосомы могут проникать в клетки либо в результате эндоцитоза, оибо за счет слияния липидной мембраны и мембраны клетки.
Адсорбция на нерастворимом носителе. В ней принимают участие водородные и электростатические взаимодействия. Таким способом можно использовать ок. 70 различных ферментов.
Носителем м. б. торф, уголь, песок, Al2O3, различные полисахариды и др.
Торф, как носитель адсорбции м. б. использован в промышленности, для удаления некоторых загрязняющих газов. Такие устрйства называются биофильтрами. Торф помещается в колонный реактор, слой торфа 1-2 метра, увлажняется водой и пропускает загрязненный газ. В результате деятельности м/о адсорбированных на торфе удаляются вредные примеси.
Преимущества такого способа:
Доступность;
Дешевизна;
Отсутствие токсического эффекта на биологический объект.
Ковалентное связывание с носителем – молекулы белков или др. поверхностные структуры клетки связываются с активированным носителем. Такое химическое ковалентное связывание может происходить с агарозой, целлюлозой и др. Гл. ограничение при использовании этого метода – на связывание объекта и носителя могут затрачиваться некоторые функционально активные группировки объектов, например, каталитический центр фермента.
Клетка (фермент) → сшивающий агент → носитель
│ ↓ ↓
─ NH3 бромциан (BrCN) сефароза
Использование иммобилизированных клеток и ферментов.
Получение L-аминокислот. Синтез аминокислот отрасль химической промышленности, но здесь получаются смеси D и L аминокислот. Такую смесь невозможно разделить физико-химическим способом. Эту смесь подвергают ацилированию:
Аминоацилаза отщепляет ацильную гр. только у L-изомера +
Ацил-L-аминокислота L-аминокислоты
Из этой смеси физико-химическим способом можно выделить ацил-D-аминокилоты.
Фермент был адсорбирован на специальных смолах, его время полуинактивации 65 сут., т. е.фермент можно постоянно добавлять и такой иммобилизированный фермент может работать ок. 8 лет при постоянном добавлении.
Получение безлактозного молока. Необходимо это в связи с лактозной недостаточностью. Такое молоко слаще обычного, в нем повышено содержание глюкозы и галактозы и оно относится к диетическим продуктам. В этом случае фермент лактозу иммобилизируют на кремнеземе и ч/з такую колонку пропускают продукт.
Лактоза м. б. использована для получения сахаров из молочной сыворотки. Это решает кормовую проблему (получение сахара из традиционных источников) и экологическую. Для этого предварительно подготавливается сыворотка. До 80% лактозы превращается в моносахара (глюкоза и лактоза).
Заменитель цельного молока для выращивания молодняка;