Векторы для клонирования высших растений.

Сегодня используется 1 вектор. Он построен на основе Ti-плазмиды. Она содержится у бактерий Agrobacterium tumefacies при инфицировании корней двудольных растений (виноград, олива, роза) может вызывать образование корончатых галлов (опухолей). Другие векторы – ДНК некоторых вирусов, хлоропласты и митохондрии ДНК – в теории.

Векторы на основе Ti-плазмиды были предложены в 1980 г. Ti-плазмиды крупные, различаются от 200 и более тыс. пар оснований, и выделением в ее составе 4 функциональных групп генов.

1. Tra – гены отвечающие за передачу Ti-плазмиды м/у клетками.

2. Rep – гены связанные с репликацией.

3. Vir – отдельно; гены вирулентности – их продукты отвечают за образование опухоли, т. е. они стимулируют синтез ИУК (индолилуксусная кислота).

4. Ок. 10% тела Ti-плазмиды – Т-ДНК - этот фрагмент способен передаваться растительной клетке и случайным образом встраиваться в одну из хромосом. Важным для вырезывания Ti-плазмид явл. наличие на концах Т-ДНК коротких последовательностей размером 25 пар оснований. За счет активности продуктов vir генов в пределах этих последовательностей происходит вырезание Т-ДНК и перенос ее в растительную клетку. Исходя из этого были сконструированы 2 типа векторов используемые для клонирования в растительных клетках.

Общим подходом для конструирования в этих векторах – клонированный фрагмент или чужеродная ДНК вводится в векторную молекулу (чаще E. Coli), затем такая рекомбинантная ДНК переносится в клетку агробактерий и уже из них она м. б. введена в растительную клетку.

1 тип векторов – о-интегративные – для их получения в клетке E. Coli конструируется промежуточный вектор. Это плазмида в составе которой есть чужеродна ДНК, селективный маркер, область гомологии с фагом Т-ДНК. Такая конструкция вводится в клетку агробактерии, в клетке агробактерии есть рецепторы Ti-плазмиды в составе которой есть vir гены, обладающие гомологией с Т-ДНК, которая ограничена последовательностью 25 пар оснований. В клетках агробактерий, в результате рекомбинации по области гомологии образуется интегративный вектор, в который входит и клонированная ДНК, в которую входит последовательность из 25 пар оснований и vir гены. Т. е., есть все возможности, чтобы последовательность, ограниченная 25 парами оснований была вырезана и передана растению.

2 тип векторов – бинарные векторы – здесь также используются 2 типа плазмид. В клетках агробактерий получена хелперная плазмида, которая создает гены вирулентности. В клетках E. coli получают бинарный вектор, который соединяет чужеродную ДНК, ограниченную 25 парами оснований. При совмещении этих плазмид в векторах бактерий продукт в транс- положении способен вырезать чужеродную ДНК и переносить ее в клетки агробактерий.