Способы введения рекомбинантных ДНК в клетку.

Рекомбинантные ДНК вводятся в клетки – реципиенты. В генной инженерии такие реципиентные клетки играют 2 роли. 1. Они позволяют отыскивать в банке генов клоны синтезируемой рекомбинантной ДНК. 2 Впоследствии такие реципиентные клетки могут использоваться для получения целевых продуктов.

Способ введения рекомбинантной ДНК учитывается на основе вектора какого типа была получена такая рекомбинантная ДНК и в клетки каких организмов необходимо ее ввести путем трансформации клетки или протопласта, или с использованием метода электропорации. Если рекомбинантную ДНК получать на основании фагов, ее можно вводить в изолированную ДНК – это трансвекция. Можно вводить интактные фаговые частицы – это инфекция (космиды, фазмиды).

Др. способы генетического обмена – конъюгация, трансдукция.

В клетках растений – трансформация растительных протопластов, обработка растительных клеток или тканей рекомбинантыми ДНК; широко используются инъекции рекомбинантных ДНК в ядро; использование липосом. Липосомы – сферические структуры, которые имеют липидную оболочку, внутри которой находится рекомбинантная ДНК. Для введения в клетки животных – вирусные инфекции, метод электропорации, микроинъекции в ядро. Если после введения рекомбинантной ДНК все клетки в организме ее наследуют, то говорят о получении трансгенного организма.

Электропорация – клетки или протопласт в течение короткого промежутка времени подвергаются воздействию тока высокого напряжения (2000-4000 вольт). В результате в мембране клетки образуются поры ок. 30 нм, которые могут существовать 1-2 минуты и ч/з которые в клетку могут поступать рекомбинантные ДНК. Затем поры закрываются, а ДНК остается в клетке. Это универсальный способ.

Баллистический метод – применятся преимущественно у эукариот. Используются баллистические пушки в которые вносятся частицы АК или W, на которые напыляются рекомбинантная ДНК. Затем, с помощью инертных газов при ↑Р, такие частицы выстреливаются из пушки в культуру клеток. По различным закономерностям часть частиц попадает в ядро и рекомбинантные ДНК там задерживаются.

Поиск клонов с рекомбинантной ДНК.

Этот этап сложен и непредсказуем.

Самый простой метод – это поиск клонов по фенотипу после введения рекомбинантной ДНК (например пигментация). Можно воспользоваться комплементационными тестами, но необходимо иметь мутантные клетки, дефективные по синтезу активного продукта.

Методы гибридизационные – необходимо наличие специфических меченых ДНК или РНК зондов. Чаще их метят Р³². Зондами м. б. короткие олигонуклеотидные последовательности, которые соответствуют наиболее консервативной части отыскиваемого гена. Эти консервативные последовательности могут включать до 100 нуклеотидов для прокариот и до 1000 для эукариот.

После введения рекомбинантной ДНК, формирующиеся на среде колонии, переносятся на специальный нитроцеллюлозный фильтр. Их подвергают лизису и последующей денатурации ДНК с использованием щелочи. ДНК прочно связывается с фильтром. Фильтр промывается и обрабатывается радиоактивным меченым зондом и определяют тот клон с которым этот зонд связался.

Иммунохимические методы – клоны после введения рекомбинантной ДНК лизируют и обрабатывают антителами к соответствующему продукту. Такие антитела – меченые.