Векторы для клонирования в клетках животных.

SV 40 – обезьяний вирус – содержит 2-нитевую ДНК размером 5 тыс. пар оснований. Он может с различным результатом размещаться в клетках макак резус и в клетках грызунов. При заражении обезьян данный вирус проходит литический цикл развития, т. е., после проникновения в цитоплазму клетки, происходит раздваивание вируса. ДНК попадает в ядро клетки, где начинается транскрипция ранних, а затем и поздних генов.

Ранние гены обеспечивают образование вирусных НК и обозначаются как T, t-антиген.

Поздние гены – обеспечивают образование 3 белков вирусного капсида VP 1, VP 2, VP 3.

В результате происходит образование зрелых вирусных частиц, ч/з 30 мин – лизис инфицированной клетки. Клетки, в которых происходит литический цикл развития – клетки пермиссивные.

Если SV 40 попадает в организм грызуна, он встраивается в одну из хромосом и развивается. Наблюдается неупластическая трансформация – непермиссивные.

Необходимо наличие точки начала репликации, наличие регуляторной последовательности, для начала транскрипции и-РНК.

Суммарные размеры рекомбинантной ДНК не должны быть более 5 тыс. пар оснований.

Либо в составе рекомбинантной ДНК, либо в составе генома клетки д. б. гены, которые обеспечивают образование белков малого и большого антигена, а также белков вирусного капсида.

В настоящее время существует 3 вектора на основе SV 40.

1. Векторы трансдуцирующие – рекомбинантные ДНК вводятся в пермиссивные клетки, которые образуют вирусные частицы.

2. Векторы плазмидные - рекомбинантные ДНК вводятся в непермиссивные клетки, в которые она за определенное время либо встраивается, либо наследуется как плазмида.

3. Векторы пассивные (трансформирующие векторы) – служат для введения ДНК в клетки, обеспечивая ее встраивание в хромосому, но сам вектор в клетке не наследуется.

С учетом этих подходов можно использовать 2 приема для введения рекомбинационной ДНК в клетку. В составе вирусной ДНК на чужеродном фрагменте можно заменить либо ранние области генома, либо поздние. В случае, если идет замещение поздней области генома, необходимо использовать вирусы-помощники, прошедшие постртрасвекции или заражение 2 типовыми вирусными частицами, которые различаются дефектам в ранней или поздней области гена. Образуется потомство с частицами без рекомбинантных ДНК и с частицами вируса-помощника.

Замещение ранней области генома – используются специальные клеточные линии (cos линии клеток) в которой содержатся гены связанные с образованием малого и большого Т-антигена и при попадании в такие клетки рекомбинантных ДНК инициируется репликация такой ДНК, синтезируются белки вирусной оболочки и образуются вирусные частицы, все из которых содержат рекомбинационные ДНК.

Также можно использовать ретровирусы, осповакцины, папиломовирусы, аденовирусы. Для клонирования в клетке-носителе - бакуловирусы.