Принципы клонирования в клетках дрожжей.

Дрожжи возбудители многих типов брожения, при этом в качестве субстрата используется широкий набор различных углеводов. Дрожжи – самые хорошо изученные представители эукариот. Они имеют геном в 3 раза больше, чем у E. coli, состоящий из 17 хромосом. Дрожи обеспечивают экспрессию и транскрипцию всех эукариотических генов.

Дрожжи быстро растут, легко культивируются, время их удвоения ок. 1,5 часа.

Для дрожжей выделены и охарактеризованы собственные плазмиды 2μ (2-микронная плазмида).

Дрожжи во многих странах признаны генетически безопасными организмами, т. е. их можно использовать для получения продуктов медицинского назначения.

При конструировании векторов для клеток дрожжей максимально используются возможные бактериальные плазмиды и собственные плазмиды дрожжевых клеток. В соответствии с этим описано 5 различных типов векторов для клонирования в клетках дрожжей:

Тип 1 – интегрирующиеся – они созданы на основе бактериальных плазмид в состав которых включены отдельные гены хромосом дрожжей. Как правило, это гены которые связаны с синтезом определенных внутриклеточных продуктов (витамины, аминокислоты и др.). тип того или иного гена определяется в комплементационном тесте (т. е. используются соответствующие мутанты не способные к выработке продукта).

Тип 2 – реплицирующиеся – получаются на основе 2μ плазмиды и имеют в своем составе помимо клонируемых генов ars-последовательности хромосом дрожжей. Это последовательности, которые обеспечивают репликацию хромосом. Они могут самореплицироваться в клетках дрожжей, но они характеризуются высокой степенью митотической нестабильности.

Тип 3 – эписомальные – содержат репликативные последовательности 2μ плазмид, репликативные последовательности бактериальных плазмид, селективные маркеры бактериальных плазмид. Это челночные векторы, которые могут наследоваться в клетках дрожжей, и в бактериальных клетках. Но они нестабильны при снятии селективного давления.

Тип 4 – центромерные (кольцевые линии хромосом), содержат ars-последовательности хромосом + CEN-последовательности (центромерные участки хромосом дрожжей) + 2μ плазмида.

Но они содержаться в 1 или 2 копиях.

Тип 5 теломерные (линейные минихромосомы). В составе таких векторов содержаться теломерные участки хромом эукариот, которые обеспечивают отсутствие чувствительности к эндомерным нуклеотидам. По сути – искусственные хромосомы дрожжей.