Методы выделения генов.

1. Химико-ферментативный синтез генов.

Осуществлен впервые в 1976 г. Гобином Корана. Это был ген, отвечающий за образование в генах дрожжей т-РНК для тирозина. Последовательность из 192n нуклеотидов.

Наиболее часто этот способ используется для генов небольших размеров, для продуктов которых установлена аминокислотная последовательность. В настоящее время синтезируется ген инсулина – 415 пар оснований.

Сначала устанавливается последовательность аминокислот в белковом продукте с учетом вырожденности генетического кода. синтез коротких (10-15 пар нуклеотидов) однонитевых комплексов фрагментов:

│ 1 │ │ 3 │ │ 1 │ │ 3 │

│ 2 │ │ 4 │ │ 2 │ │ 4 │

Затем такие синтезированные фрагменты смешиваются м/у собой, добавляется АТФ, изомераза, липаза. За счет случая идет объединение объектов. В результате в смеси продуктов реакции м. б. получены и интактные (необходимые) гены.

Возможно определить не только последовательность аминокислот в белке, но и нуклеотидную последовательность в ДНК. Этот процесс называется – секвенированием.

2. Выделение генов из природных (нативных) ДНК.

Шот-ган клонирование, метод «дробовика» - используется гидродинамическое воздействие на НК, либо рестриктазы II класса. В результате соединения выделенных фрагментов ДНК с векторными молекулами образуется банк генов (библиотека) ДНК. Задача банка генов – представить количество клеток, в которых содержаться все гены данного организма в составе векторных молекул или рекомбинантных ДНК. Совокупность всех генов E. coli при использовании как вектора плазмиды Со/Е1 – составляет 1000 клеток. для млекопитающих ок. 1 млн. для обнаружения всей или большей части их генов. Метод дешевый, простой, но:

Трудно подобрать такой способ воздействия на ДНК, чтобы м. б. выделить интактный активный ген.

При клонировании генов эукариот в клетках бактерий не происходит удаление интронов.

Если размеры гена малы, то возникают сложности с его обнаружением в клетке.

3. Синтез гена на м-РНК, как матрице (получение комплемента (к- ДНК).

На первом этапе из клетки выделяется м-РНК, которая синтезируется в клетках, находящихся на определенной стадии роста. Или на определенных типах тканей.

м-РНК АААА

^{образование транскрипта} ↓ ^{полиаденилированный участок}

м-РНК ААА

ДНК

↓^{ДНК-аза}

к-ДНК

К м-РНК добавляются тиминовые нуклеотиды и обратные транскрипты. На м-РНК с использованием полиадениловых фрагментов, как начало матрицы и за счет синтеза обратной транскриптазы образуется комплементарная ДНК. На следующем этапе используется щелочной гидролиз или РНК-аза, удаляющие нить м-РНК. Образуется 1-нитевая ДНК. После этого в присутствии НК, фермента ДНК-полимеразы и Лигазы на нити ДНК как на матрицу синтезируется комплементарная цепь.

М/у 2 и 3 процессами существует разница. В случае комплементарной ДНК получаются части генома, которые транскрибировались в м-РНК в данный тип клеток и в данный конкретный момент времени. Создается банк генов комплементарных ДНК. При использовании 2 способа мы имеем набор последовательности ДНК, соединенной с вектором.

Векторные молекулы – это молекулы ДНК способные переносить и стабильно поддерживать в реципиентной клетке чужеродную генетическую информацию. Вектором м. б. ДНК плазмид, вирусов, в т. ч. фагов. Векторы обладают следующими свойствами:

Вектор должен быть репликоном и стабильно поддерживать в клетке, т. е. он должен распространятся в клетке как хромосомы в бактерии;

Вектор должен иметь селективный маркер, позволяющий определить его наличие в реципиентной клетке (устойчивость к антибиотикам;

Вектор должен иметь небольшое количество сайтов узнавания рестриктаз. Но количество рестриктаз должно быть мах. разнообразным.

Емкость вектора – размер чужеродной ДНК, которую он может переносить без потери стабильности клетки. Фрагменты очень большого размера, вводимые в клетки теряются.