Генная инженерия – совокупность методов для создания организмов с заданными свойствами in vitro.
Если при использовании ГИ меняются метаболические особенности органа (появление активных ферментов), то говорят об использовании методов ГИ.
Рекомбинантные ДНК – векторная молекула с которой соединяется гетерологичная (чужеродная) ДНК; молекула которая получается в неживой клетке путем соединения природных или синтетических фрагментов ДНК с молекулами ДНК которые способны реплицироваться в клетке.
1972 г. – начаты исследования по ГИ в лаборатории Берга. Получена первая рекомбинантная ДНК, которая представляла собой фрагмент вируса SV 40, фрагмент E. coli, фрагмент оперона.
Основу составили такие научные открытия как: оперон, принцип организации хромосом, модель репликации, обнаружено явление деструкции – модификация любой чужеродной ДНК, которая проникнет в клетку и будет разрушена, исследования по химическому синтезу гена.
Значительным успехом ГИ было клонирование гена – соматостатин (гормон роста) – мелкий пептид из 14 аминокислот, клонирован в клетках E. coli. На первом этапе была установлена аминокислотная последовательность, химическим путем был синтезирован ген, затем он был соединен с плазмидом pBR 322. такая конструкция была введена в клетку, но пептид из-за малого размера подвергался внутриклеточному протеолизу. Для устранения этого ген был соединен с ферментом β-галактоксидазой. В клетке E. coli может накапливаться до 10 тысяч молекул этого белка.
ГИ послужила основой для направлений: клеточная инженерия и инженерная энзимология.
Инструментами ГИ являются:
1. Ферменты действующие на НК.
Ферменты используемые для получения фрагментов ДНК. Рестрикционные нуклеазы (рестриктазы) – способны вносить разрывы в молекулы ДНК и РНК.
Классы по способу осуществления разрыва:
I класс – способны вносить разрывы в произвольные участки ДНК, обладают метилазной активностью (метилируют определенные азотистые основания). Для проявления активности нуждаются катионах 2-валентных атомов и АТФ.
II класс – более широко используются, узнают строго специфические последовательности нуклеотидов и производят разрывы внутри них. Обладают только нуклеазной активностью. Узнают последовательности от 4 до 20 нуклеотидов (чаще 6-8), не нуждаются в АТФ. Расщепление идет в направлении 5'→3', способны расщеплять ДНК с образованием тупых (прямых) концов или липких концов, т. е. выступающих однонитчатых фрагментов. В настоящее время выделено ок. 2 тыс. рестриктаз, которые способны узнавать ок. 150 нуклеотидных последовательностей.
III класс – узнают определенные последовательности, но производят разрывы ДНК на некотором расстоянии от них.
Изомеры – несколько рестриктаз, узнающих одну и ту же последовательность.
Эндонуклеаза EcoR1 – разрезает ДНК в тех местах, где встречается последовательность 5'-GAATTC-3'. Эта последовательность является палиндромом, т.е. в обеих цепях точно напротив друг друга находятся одинаковые последовательности, читаемые в направлении 5'→ 3’. EcoR1 гидролизует фосфодиэфирные связи м/у остатками G и А в каждой цепи. Поскольку EcoR1 разрезает обе цепи в том месте, где встречается палиндромная последовательность 5'-GAATTC-3', молекула ДНК разрезается на характерный для нее набор фрагментов («фингерпринт» – «отпечатки пальцев»).
2. Векторы или переносчики генов.
Синтезируют НК с использованием в начале матрицы ДНК или РНК.
РНК-зависимая ДНК-полимераза (обратная транскриптаза) – синтезирует ДНК с использованием в качестве матрицы м-РНК.
Бактериальная ДНК-полимераза I синтезирует ДНК на ДНК матрицы.
3. Искусственные олигонуклеотиды, с помощью которых объединяются, синтезируются, отыскиваются и анализируются гены.
Процесс соединения фрагментов ДНК – лигирование. Ферментами являются ДНК-липазы, они изменяют структуру концевых участков ДНК; либо достраивают нуклеотиды – полинуклеотидкиназы; либо удаляют концевые нуклеотиды – нуклеазы.
Ферменты, которые используются для получения гибридизационных зондов (фрагменты НК, которые содержат радиоактивно меченые участки определенных генов) для их получения используется ДНК-полимераза I, которая обладает и полимеразной, и эндонуклеазной активностью.
