русс | укр

Языки программирования

ПаскальСиАссемблерJavaMatlabPhpHtmlJavaScriptCSSC#DelphiТурбо Пролог

Компьютерные сетиСистемное программное обеспечениеИнформационные технологииПрограммирование

Все о программировании


Linux Unix Алгоритмические языки Аналоговые и гибридные вычислительные устройства Архитектура микроконтроллеров Введение в разработку распределенных информационных систем Введение в численные методы Дискретная математика Информационное обслуживание пользователей Информация и моделирование в управлении производством Компьютерная графика Математическое и компьютерное моделирование Моделирование Нейрокомпьютеры Проектирование программ диагностики компьютерных систем и сетей Проектирование системных программ Системы счисления Теория статистики Теория оптимизации Уроки AutoCAD 3D Уроки базы данных Access Уроки Orcad Цифровые автоматы Шпаргалки по компьютеру Шпаргалки по программированию Экспертные системы Элементы теории информации

Подходы к генетическому изменению объектов биотехнологии, in vivo.


Дата добавления: 2014-05-17; просмотров: 1304; Нарушение авторских прав


Для улучшения продуктивности пользуются методами селекции – получение мутантов, наследственность которых претерпевает скачкообразные изменения в последовательности нуклеотидов ДНК. У м/ото возможно при проведении мутагенеза или использовании способов генетического обмена.

По своей способности продуцировать метаболиты м/о м. б.:

Первичные метаболиты – аминокислоты, НК – это мономеры биополимеров; эти соединения клетки синтезируют в количествах необходимых для роста и развития.

Вторичные метаболиты – соединения необязательные для роста клетки. Синтезируются на определенной стадии роста (антибиотики, гормоны растений, пигменты, алкалоиды, токсины и др.).

Природные штаммы м/о вторичные метаболиты выделяют в незначительных количествах. Некоторые м/о могут выделять первичные метаболиты – глутаматпродуцирующие бактерии.

Штаммы м/о, продуцирующие более 2% (15-30 г/л – аминокислоты) – являются суперпродуцентами (сврхпродуцентами).

Для обеспечения такой сверпродуктивности мутации делят на главные и вспомогательные.

Главные мутации – обеспечивают образование в клетках высоких количеств нужных метаболитов.

Вспомогательные – обеспечивают высокие скорости поглощения ростовых субстратов, более высокие способности к секреции ( выделению) продукта из клетки.

Лизин (предшественник ЦТК) → asp – полуальдегид asp→ гомосерин → метионин

→ лизин(!)→ тиронин → изолейцин

(!)лизин ингибирует выделение гомосерина и, соответственно, метионина, тиронина, изолейцина.

Биогенные элементы:

Поступая в клетку в виде соединений, биогенные элементы претерпевают изменения и включаются в различные циклы. Затем наблюдаются реакции м/у соединениями, они могут образовывать новые метаболиты, взаимодействовать м/у собой и участвовать в дальнейших превращениях; удаляться из клетки. В результате мутагенеза можно повысить скорость поглощения субстрата; повысить уровень синтеза или активности ферментов; блокировать побочные реакции синтеза и снизить расход предшественников на синтез др. метаболитов; блокировать дальнейшие внутриклеточные превращения или деградацию продукта. Усилить эффективность выделения продукта из клетки.



До начала мутагенеза культуру чистят. Из рассева культуры отбирают ок. 100 отдельных клонов и у них проверяют количество образуемого продукта. Этот процесс проводят с каждым отдельным клоном несколько раз. Отбирают 1 или несколько наиболее продуцирующих клонов (продуктивность в г/л, для ферментов – единицах активности фермента). После рассева и проверки клоны м. б. подвергнуты мутагенезу. Воздействию мутагенных факторов можно подвергать споры, вегетативные клетки, обрывки мицелия.

Предпочтения отдаваемые м/о связаны с их вегетативным размножением, гаплоидным набором хромосом, большим числом особей для анализа, быстрое время регенерации популяции.

Мутагенными факторами могут выступать физические факторы или химические соединения. Химические соединения необходимо использовать с максимальной активность мутагенного проявления –t, рН, концентрация выбор мутагена и др.).

К мутагенам химической природы относят:

Нитрозометилмочевина;

Нитрозогуанидин;

Акридиновый оранжевый и др.

После получения мутантов, среди них отбирают те, которые соответствуют требуемым параметрам следующими способами:

1. Случайный отбор и последующая оценка данного количества признаков.

2. Отбор мутантов с определенным фенотипом.

 

Отбор случайных мутаций.

Используется в случае, если нет данных о путях синтеза желаемого продукта. Например, создание продуцентов пенициллина. Этот продукт используется более 50 лет. В начале применения был известен только штамм продуцента, он давал ок 500 единиц на 1 литр раствора. В результате последовательной обработки мутагенами (УФ, нитросоединения), были получены в несколько стен раз более эффективные штаммы. В настоящее время, это ок. 500 тыс. единиц в 1 мл. Соответственно цена на препарат упала в разы. Такой мутагенез, который осуществляется в несколько стадий с проверкой продукта – называется ступенчатым отбором с применением мутагена.

Отбор среди мутантов с определенным фенотипом.

Отбор среди акусотрофных мутантов.

Среды в микробиологии.

Все питательные среды по составу делятся на натуральные и синтетические.

Натуральные – это среды, состоящие из продуктов животного или растительного происхождения, имеющие неопределенный химический состав. Это м. б. смесь продуктов распада белков (казеина, мышц млекопитающих), образующихся при их гидролизе. Кислотный (HCl) гидролиз белков используется для приготовления полных гидролизатов. Действие ферментов типа трипсина, панкреатина, папаина приводит к частичному (неполному) гидролизу белков, в результате чего образуются пептоны. Замечено, что на пептонных питательных средах м/о растут лучше, чем на питательных средах, приготовленных из полных гидролизатов или смесей аминокислот. Вероятно в этом случае сохраняются лабильные факторы роста. Кроме того, многие м/о лучше размножаются на средах, содержащих небольшие пептиды, потому что их они могут усваивать непосредственно.

К питательным средам неопределенного состава можно отнести и среды, полученные на основе растительного сырья: картофельный агар, томатный агар, отвары злаков, дрожжей, пивное сусло, настои сена и соломы.

Основное назначение таких питательных сред – выделение, культивирование, получение биомассы и поддержание культур м/о.

Полусинтетические – это среды неопределенного состава, которые дополнены известными соединениями (явно необходимыми), а также небольшим количеством дрожжевого или кукурузного экстракта и др., для обеспечения неизвестных потребностей роста. Такие среды используют при промышленном культивировании биологических объектов для получения продуктов метаболизма.

Синтетические среды – это среды определенного состава, представленные чистыми химическими соединениями, взятыми в точно указанных концентрациях и соотношениях отдельных элементов. Обязательными компонентами таких сред явл. неорганические соединения, N-, C-содержащие в-ва. Часто к ним добавляют буферные растворы и хелатирующие соединения. Ауксострофные бактерии растут на простых синтетических средах при внесении определенных биологических в-в.

Основное назначение таких питательных сред – изучение особенностей физиологии и метаболизма м/о, выделение генетических рекомбинантов и др.

По назначению среды делят на элективные и дифференциально-диагностические.

Элективныесреды обеспечивают преимущественное развитие одного или целой физиологической гр. м/о. например, для преимущественного выделения Г - бактерий достаточно добавить в среду трифенилметановый краситель (кристаллический фиолетовый, малахитовый зеленый и др.). для выделения стафилококков можно добавить NaCl в концентрации 7,5%.

Дифференциально-диагностические среды используются для быстрой идентификации близкородственных видов м/о, для определения видовой принадлежности, в клинической биологии и др.

В состав ДДС входят:

Ø Основная питательная среда, обеспечивающая размножение бактерий;

Ø Определенный химический субстрат, отношение к которому явл. диагностическим признаком для данного м/о;

Ø Цветной индикатор, изменение окраски которого свидетельствует о биохимической реакции и наличии данной ферментативной системы у исследуемого м/о.

По консистенции среды м. б. жидкими, полужидкими, твердыми, сыпучими.

Жидкие получают при растворении в воде определенного набора питательных в-в, макро- и микроэлементов. По составу они м. б. натуральными и синтетическими.

Твердые среды получают добавлением к жидким уплотнителей: агар, желатин, силикагель, карраген.

Полужидкие среды содержат гелеобразующее в-ва в низкой концентрации (0,3-0,7%) и имеют мягкую желеподобную консистенцию. Такие среды пригодны для изучения подвижности и хемотаксиса клеток, культивирования микроаэрофилов.

Сыпучие среды – масса сырья разной степени измельченности (чаще растительное). Используются в пищевой промышленности (получение соевого соуса), в с/х – силос.

В норме бактерии окружающей среды называются бактериями дикого типа и способны к росту на простых синтетических средах – соли в строгой дозировке. Такие бактерии называются прототрофными.

Эти мутанты по определенным аминокислотам часто явл. продуцентами др. аминокислот:

продуценты меланина ауксотрофы по триптофану и фенлиаланину, т. к. он образуется из тирозина.

Ревертанты ауксотрофным мутантов.

Гены расположены на хромосоме сцеплено, восстановление функции одного гена может привести к восстановлению функции гена, которая приведет к более высокому уровню синтеза конечного продукта. Для бактерий Bacillus было показано, что гены отвечающие за синтез аминокислот гистидина и триптофана сцеплены.

Восстановление гистидина привело к гиперфункции триптофана. Реверсия была связана со вставкой основания. Это привело к сдвигу рамки считывания и изменению регуляторных областей триптофанового оперона. В этом случае и-РНК связывается с этим геном.

Мутанты устойчивы к структурным аналоговым соединениям.

Структурные аналоговые соединения: триптофан: 5-Нтриптофан;

5-Fтриптофан.

Эти аналоги могут поступать в клетку и включаться в белки. Однако такие белки не способны выполнять свои функции, а клетки не могут расти. Если посеять исследуемые клетки на среды с аналоговыми аминокислотами, то вырастут те, которые образуют аминокислоты в огромном количестве и структурные аналоги не ингибируют их рост.

Мутанты устойчивые к антибиотикам.

Способны синтезировать антибиотики аналогичные в химическом отношении групп.

С использованием такого подхода был получен гентамицин. Для его получения образцы почвы высевали на среду с родственным септомицином.

Мутанты, устойчивые к антибиотикам могут обладать некоторыми изменениями в физиологии. В частности, клетки устойчивые к рифампицину характеризуются измененной структурой РНК-полимеразы.

Мутанты морфологические: отбор объектов основан на том, что многие мутации имеют плейаморфный характер. Например, клетки которые образуют экзополисахариды имеют слизистую морфологию колонии.

Мутанты, которые получали в условиях подавления признака.

Например, характеристика мутанта продуцента глутаминовой кислоты; бактерии образуют достаточное количество глутаминовой кислоты (50 г/л) на дешевом сырье, которое является переработанной сахарной свеклой. Но оказалось, что среда содержит повышенные концентрации биотина, что подавляет развитие продуцентов. Для подавления эффекта провели поиск устойчивых мутантов и был отобран штамм, нечувствительный к повышенному содержанию биотина.

Метод получения генетических рекомбинантов.

Может быть использован для всех групп организмов. Применительно к клеткам бактерий могут быть использованы все способы генетического обмена: конъюгация (требуется непосредственный контакт клетки донора и реципиента) → был сконструирован штамм, который был способен к росту на таких источниках С как: нафталин, камфара, октан. Для его получения в одну из клеток бактерий рода Pseudomonas были совмещены 4 различные плазмиды (плазмиды биодеградации). Каждая из них обладала способностью утилизировать одно из указанных соединений. На создание такого штамма, который был назван супербацилла, был впервые выдан патент на способ конструирования живого организма – объекты биотехнологии явл. предметом изобретения.

Трансформация – происходит обмен генетической информацией за счет введения в реципиентную клетку изомеризированной ДНК донора. Например, бактерии рода Bacillus оказались способными синтезировать фермент амилазу в 14 раз больше в сравнении с бактериями дикого типа после введения 2 генов: регуляторного (обеспечивающего повышенную транскрипцию) и гена отвечающего за секрецию фермента.

Трансдукция – в клетку реципиента ДНК поступает с участием бактериофага. Т. о. был создан штамм продуцентов аминокислоты лейцина и аргинина. Когда на 1-м этапе были получены мутанты устойчивые к аналогам этих аминокислот. Затем мутанты были совмещены в одной клетке.

Метод слияния протопластов и сферопластов.

Клетки, лишенные клеточных стенок могут быть получены из разных организмов (искл. животные клетки не имеющие клеточных стенок) – протопласты.

Клетки имеющие остатки клеточной стенки – сферопласты.

Этот метод м. б использован:

Для введения рекомбинантной ДНК;

Для слияния протопласта.

Для бактерий сферопласты и протопласты м. б. получены в результате воздействия антибиотиков ингибирующих синтез клеточной стенки (β-лактамные пенициллины); ферментов разрушающих стенку (лизоцим).

Сферо- и протопласты способны сохраняться только в гипертоническом растворе (в высокоосмотической среде). Способны регенерировать клеточную стенку – реверсия. Для индукции слияния используются некоторые химические соединения (нитраты, соли К, полиэтиленгликоль – ПЭГ). Они обладают сильной гидрофильностью, связывают молекулы воды и тем самым обеспечивают на 1 этапе слияние мембран клеток, образование мостиков слияния и объединение цитоплазмы 2 клеток. В ветеринарии существует необходимость использования противопротозойных препаратов. Путем слияния протопластов получается антибиотик авермиктин. Исходный штамм образует 8 типов авермиктина. Наиболее активен: B1a, B2b.

Метод слияния протопласта позволил совместить в одной клетке все благоприятные для продуцента мутации. Для некоторых групп бактерий эффект процесса очень высок.

Метод слияния протопласта позволил осуществить гибридизацию для таксономически отдаленных групп организмов, и используется в тех случаях, когда др. способы обмена генами невозможны.

 



<== предыдущая лекция | следующая лекция ==>
Виды микроорганизмов используемые в биотехнологии. | Создание биологических штаммов in vitro.


Карта сайта Карта сайта укр


Уроки php mysql Программирование

Онлайн система счисления Калькулятор онлайн обычный Инженерный калькулятор онлайн Замена русских букв на английские для вебмастеров Замена русских букв на английские

Аппаратное и программное обеспечение Графика и компьютерная сфера Интегрированная геоинформационная система Интернет Компьютер Комплектующие компьютера Лекции Методы и средства измерений неэлектрических величин Обслуживание компьютерных и периферийных устройств Операционные системы Параллельное программирование Проектирование электронных средств Периферийные устройства Полезные ресурсы для программистов Программы для программистов Статьи для программистов Cтруктура и организация данных


 


Не нашли то, что искали? Google вам в помощь!

 
 

© life-prog.ru При использовании материалов прямая ссылка на сайт обязательна.

Генерация страницы за: 0.238 сек.