Для практических измерений необходимо, чтобы регистрация проводилась на восходящемучастке кривой доза-эффект, этот участок используется в качестве калибровочного графика (стандартной кривой).
Калибровочная кривая строится для каждого индивидуального белка, для каждого прибора, при любом изменении условий регистрации и периодически по мере проведения исследований. При серийных исследованиях в стандартных условиях допускается корректировка графика на основании измерения одного из стандартов. Это основано на наблюдении о том, что характерный вид стандартной кривой не меняется из-за влияния систематических факторов, а происходит параллельный сдвиг всего графика. В этих случаях производят пересчет графика, так, чтобы он шел параллельно первичной кривой, но проходил бы через новую точку. Для построения калибровочного графика используются стандарты, которые фирма-поставщик соответствующих тест-наборов обязана предоставлять пользователям или их необходимо выписывать отдельно.
Многие современные приборы (турбидиметры и нефелометры) способны определять и отслеживать избыток антигенов автоматически. Процедура основана на регистрации ускорения реакции после добавления дополнительного количества антигена, в качестве которого используются малые дозы калибратора. Если после дополнительного внесения в реакционную среду антигена, реакция ускоряется, то, следовательно, реакция протекает с избытком антител и измерение проводится верно, на восходящем отрезке кривой доза-эффект. Если же дополнительное добавление антигена не приводит к ускорению
преципитации, то измерение проводится при избытке антигена на нисходящем отрезке кривой доза-эффект. Измерение необходимо повторить при обязательном разведении образца, так как в нем имеется избыток антигена.
При постановке иммунотурбидиметрических реакций на обычном фотометре для предупреждения ошибки, связанной с избытком антигена, необходимо знать диагноз заболевания. Следует подчеркнуть, что избыток антигена чаще всего наблюдается в чрезвычайных ситуациях. Например, при миеломной болезни концентрация IgG (Ag) может быть очень высокой, и исследование попадает в зону избытка антигена. Чтобы избежать такой ошибки, необходимо знать диагноз и оценить данные электрофоретического определения белков и концентрации общего белка. При наличии М-градиента и высокой концентрации общего белка пробу на IgG нужно развести и повторно определить IgG иммунотурбидиметрическим методом.
Методы турбидиметрии и нефелометрии можно автоматизировать, что делает возможным получение результата анализа в течение нескольких минут. При сравнении методов турбидиметрии и нефелометрии, как правило, считается, что нефелометрический метод более чувствителен, так как в этом случае измеряется только рассеянный свет. При турбидиметрических измерениях в относительно прозрачных средах, когда проходит до 95 % светового потока, достаточно трудно избавиться от небольших флуктуаций в работе источника излучения и нестабильности всей измерительной системы. Тем не менее, за последнее время созданы достаточно стабильные высокоразрешающие фотометрические системы, поэтому турбидиметрические измерения стали конкурентными с нефелометрическими методами по чувствительности для количественных иммунохимических измерений в клинической биохимии.
Методы позволяют с высокой специфичностью и чувствительностью определять концентрацию белка в количестве 1 мг в литре. При более низких концентрациях нефелометрия остается предпочтительным методом.
Подчеркиваем, что в качестве стандартов и контрольных материалов для турбидиметрии и нефелометрии необходимо использовать специально подготовленные стандарты и контрольные сыворотки, содержащие индивидуальные белки, концентрация которых измерена турбидиметрическим или нефелометрическим методами с использованием иммунохимической реакции.
