Простейшая схема измерения изображена на рисунке 56. Эта схема подразумевает, что интенсивность светового потока, падающего на исследуемый раствор известна. Измерить абсолютное значение интенсивности этого потока с достаточной точностью невозможно, так как часть падающего потока отражается от стенок сосудов содержащих раствор и учесть величину этого отражения сложно. Поэтому в аналитической химии и биохимии проводят
относительные фотометрические измерения. Метод измерения оптического поглощения исследуемого раствора относительно раствора сравнения в одной и той же спектральной полосе излучения реализуется двумя основными схемами:
1. Схемой фотометрирования с одним световым лучом (однолучевое фотометрирование).
2. Схемой фотометрирования с двумя световыми лучами (двухлучевое фотометрирование).
Система для выделения (фильтрации) излучательной энергии необходимой длины волны и подавления других длин волн называется монохроматором. Существуют различные способы фильтрации, включая использование фильтров, призм, и дифракционных решеток. Комбинации линз и щелей могут устанавливаться до и после монохроматического устройства, чтобы сделать световые лучи параллельными или выделить узкие световые потоки. Щели переменной ширины используются для регулирования световыми потоками, достигающими фотоприемник. Выбор типа монохроматора зависит от целей аналитических исследований. Узкополосные фильтры желательно использовать в пламенной фотометрии, чтобы выделить излучение на данной длине волны. Узкая спектральная полоса требуется также в спектрофотометрах при идентификации острых смежных спектральных пиков поглощения. В том случае, когда часть излучения монохроматора не поглощается исследуемым веществом, происходит нарушение закона Бера. Обычно это наблюдается в широкополосных устройствах. При уменьшении спектральной полосы может увеличиться поглощение и улучшиться линейная связь с концентрацией. Это особенно важно для веществ, которые имеют острый спектральный максимум поглощения.
Монохроматор – это оптическая система для выделения узких участков спектра излучения с заданной длиной волны. Простой монохроматор включает входную щель, коллиматор, диспергирующее устройство, фокусирующий объектив и выходную щель.
Выходная и выходная щели монохроматора предназначены для получения достаточно резкого и четкого изображения спектральной линии оптического излучения, качество которого определяется размерами щелей – шириной и высотой. Щели обычно имеет размеры прямоугольника. Щечки (края) щелей перемещаются с помощью винта с высокой точностью (до 1 мкм). Рабочая ширина щелей зависит от ширины полос пропускания и составляет до 1 мм. Щели необходимо предохранять от загрязнения пылью, для этого их закрывают специальной насадкой.
Коллиматор – это оптическое устройство, предназначенное для получения параллельных пучков белого света, направляемых на диспергирующую систему. Он состоит из объектива или вогнутого зеркала, в фокусе которого располагается входная щель. В современных приборах широко используются монохроматоры с автоколлиматорными устройствами, в которых совмещены функции объектива коллиматора, входной щели и фокусирующего объектива. В таких приборах свет проходит через один и тот же объектив дважды в прямом и обратном направлении, что позволяет уменьшить размеры спектрофотометра, сделать его компактным и удешевить.
Диспергирующим устройством может быть как призма, так дифракционная или
голографическая решетка. Обязательной частью монохроматора является механическое устройство для изменения положения диспергирующей системы по отношению к падающему лучу. Это обеспечивает изменение спектральной линии, подаваемой на выходную щель.
