Иной подход при создании люминесцентных сенсоров состоит в использовании собственной биолюминесценции живых организмов. В природе обнаружены уже порядка тысячи биолюминесцирующих организмов, большинство из которых обитает в морях. На больших глубинах, куда уже не проникает внешний дневной свет, биолюминесценция оказывается чуть ли не единственным источником света и одним из главных средств коммуникации. Наземных самосветящихся организмов (бактерий, насекомых, "светлячков") намного меньше. Установлено, что за биолюминесценцию ответствен, как правило, белок люцифераза. Для свечения он использует энергию, выделяемую при окислении небольшой органической молекулы – люциферина. Люцифераза служит специфическим катализатором реакции его окисления, и часть освобождающейся при этом энергии излучает в виде биолюминесценции.
В 90-х гг. ХХ в. ученые стали активно заниматься созданием генно-инженерных конструкций для биолюминесцентных сенсоров. В основу таких конструкций чаще всего положена схема самозащиты клеток, выработанная за миллионы лет эволюции живых организмов (рис. 22.4).
.files/image2221.gif)
Рис. 22.4. Функциональная схема самозащиты живых клеток: 1 – токсины; 2 – распознаватель; 3 – репрессор; 4 – промотор; 5 – синтезатор; 6 – нейтрализатор
Если в живую клетку проникают "токсины" 1 – объекты, несущие угрозу нормальному функционированию клетки, – то там их ожидает белок-распознаватель 2, своего рода "сторож". Как только он "узнает" опасный токсин, то подает сигнал белку-репрессору 3, который до сих пор блокировал работу белка-промотора 4. Этот последний запускает в работу "синтезатор" – молекулу РНК, на которой синтезируются вещества 5, нейтрализующие токсины 1. Пока токсинов 1 нет, синтез этих веществ не нужен и потому блокируется, чтобы не расходовать понапрасну ресурсы клетки. Часто один и тот же белок одновременно является и распознавателем, и репрессором.
Для того, чтобы по такой схеме создать биолюминесцентный сенсор, в неё надо добавить биолюминесцирующий белок, например, люциферазу, а в качестве "синтезатора" использовать РНК, на которой синтезируются молекулы люциферина. Функциональная схема такого биолюминесцентного сенсора показана на рис. 22.5. Когда в окрестности распознавателя 2 появляются частицы аналита 1, на который "настроен" этот распознаватель, он связывается с такой частицей и сигнализирует об этом репрессору 3. Последний "освобождает" промотор 4, который запускает в "синтезаторе" 5 синтез люциферина. Появившиеся молекулы люциферина 6 в присутствии люциферазы 7 окисляются, и в результате высвобождающейся энергии возникает биолюминесценция. При отсутствии аналита синтез люциферина блокирован, и клетка не светится. Возможен и противоположный вариант: пока частиц аналита 1 нет, промотор 4 свободен, синтез люциферина идёт, и люциферин постоянно светится. Но как только частицы аналита появляются, распознаватель сигнализирует об этом репрессору, который блокирует работу промотора, синтез люциферина прекращается, и биолюминесценция исчезает.
.files/image2223.gif)
Рис. 22.5. Функциональная схема биолюминесцентного сенсора: 1 – аналит; 2 – распознаватель; 3 – репрессор; 4 – промотор; 5 – синтезатор; 6 – люциферин; 7 – люцифераза
Сейчас уже отработана стандартная процедура создания генно-инженерных конструкций, обеспечивающих воспроизводство подобных биолюминесцентных клеток-сенсоров. Основой для них обычно служит плазмида бактерии Escherichia coli. В неё встраивают нужные дополнительные гены, взятые из ДНК соответствующих организмов. Реконструированную ДНК методами генной инженерии "запускают в работу" по производству закодированной в ней клетки. В результате появляется живая биолюминесцентная клетка с требуемыми свойствами. Затем созданные "бактерии-сенсоры" культивируют: наращивают в требуемых количествах в специальных питательных средах.
Например, в ГосНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов (Москва) создали подобного рода биолюминесцентный сенсор, реагирующий на появление мышьяка. Ген для синтеза распознавателя мышьяка взяли у бактерии, у которой он имеется от природы. Люкс-ген взят от наземной светящейся бактерии — Photorhabdus luminescens, в ДНК которой участки, кодирующие синтез люциферазы и люциферина, расположены рядом, так что их удобно "вырезать". В этом же НИИ таким же методом генной инженерии созданы также биолюминесцентные сенсоры, распознающие присутствие солей тяжелых металлов, антибиотиков ампициллинового и тетрациклинового рядов, наличие гептила (ракетного топлива, которое вредно влияет на живые организмы) и т.д.
Интересной находкой стала реализация биолюминесцентного сенсора, который обнаруживает появление в организме веществ, посредством которых "согласуют" свои действия болезнетворные бактерии. Появление такого вещества означает, что в организме накопилось достаточно много бактерий, чтобы начать коллективную атаку на организм хозяина. По появлению этого вещества можно зафиксировать начало, "старт" инфекционного заболевания.
По существу каждую из произведенных с помощью генной инженерии специальных бактерий можно считать законченным биолюминесцентным сенсором. Ведь в ней есть (см. лекцию 1) и чувствительный элемент ("распознаватель"), и усилитель-селектор сигналов (репрессор, промотор и синтезатор), и сигнализатор (биолюминесцирующий белок). Однако этот микроскопический сенсор-клетка мало приспособлен для восприятия его сигналов людьми и макроскопическими приборами. Биолюминесценция отдельной белковой молекулы весьма слаба, и её очень трудно заметить на фоне других световых помех. Поэтому обычно используют большое количество (миллионы и миллиарды) таких бактерий. Но даже и их совместное свечение выделять из сторонних световых помех непросто, поскольку оно никак не модулировано. В этом отношении сенсоры с фотолюминесцентными маркерами имеют значительное преимущество. Ведь возбуждающее облучение в них можно специально модулировать, и точно так же будет модулирован и свет их фотолюминесценции. Благодаря этому слабую фотолюминесценцию можно выделить на фоне даже значительных, но не модулированных или по-иному модулированных помех.
Биолюминесцентный сенсор – это живая клетка. Поэтому в биолюминесцентных сенсорах надо обеспечивать условия для поддержания жизнедеятельности клеток. Люминесцентный маркер – это макромолекула, которая не требует жестких условий жизнеобеспечения. В этом тоже состоит преимущество сенсоров с люминесцентными маркерами. Зато живые клетки биолюминесцентных сенсоров легко размножать в питательных средах. В то время, как макромолекулы люминесцентных маркеров надо синтезировать искусственно.
