Успех «Низара» во многом был предопределен тем, что у истоков его стояли люди, одержимые своей идеей и имеющие очень высокую квалификацию, причем в разных областях.
И сейчас в компании не отступают от этого принципа: из 52 человек штатных сотрудников 10 являются кандидатами наук, 90% всех работников имеют высшее образование. Также в компании работают юрист и патентовед.
Ученый должен реализовывать свой потенциал, а не думать о том, как обеспечить свою семью. Этот принцип лежит в основе действующей системы оплаты труда. При этом в «Низаре» уже все привыкли к индивидуальной оплате и дифференцированным размерам заработной платы. Специалистов, от которых зависит жизнедеятельность компании, здесь ценят и платят им больше, чем предлагают другие фирмы.
«Мы уже сделали революцию в косметике, придумав линию «голубой крови», и у нас есть возможность произвести еще одну революцию в ближайшие пять лет. И это будет не только большое слово в науке, но и очень полезная вещь». (Умар Ахсянов).
Нужна ли "голубая кровь" микроорганизмам?
Кровь - жидкая «ткань, осуществляющая в организме транспорт химических веществ (в т. ч. кислорода), благодаря которому происходит интеграция биохимических процессов, протекающих в различных клетках и межклеточных пространствах, в единую систему» [1].
Если провести аналогию этого определения, приведенного в медицинской энциклопедии, с глубинным культивированием микроорганизмов, то по своей сути кровь является той культуральной средой, в которой размножаются, живут, развиваются и выполняют свои функции клетки макроорганизма. Кровь выполняет газотранспортную, защитную, терморегуляторную, питательную, гомеостатическую и другие функции. Несмотря на выполнение многих функций в организме, газотранспортная или дыхательная функция поставлена при описании физиологии крови на первое место [1]. Транспорт газов, осуществляемый кровью, представляет уникальную сложную систему обеспечения каждой клетки макроорганизма кислородом и удаления газообразных продуктов метаболизма. Микроорганизмам (прокариотам и эукариотам) жизненно необходим кислород [2]. Он непосредственно участвует в различных биохимических реакциях, обеспечивающих процессы жизнедеятельности микробов. Кислород является важнейшим элементом, используемым микроорганизмами для построения структурных компонентов микробной клетки и получения энергии, его доля в сухом веществе клетки составляет 30-35%, в активных вегетативных клетках его содержание за счет кислорода воды, углеводов, липидов, белков, нуклеиновых кислот достигает 82-90%.
Кислород поступает в клетки в составе воды, диоксида углерода и органических соединений. Кроме того, он содержится в СО2 и многих органических соединениях. Однако подавляющему большинству используемых в биотехнологии микроорганизмов крайне необходим молекулярный кислород. Кислород является наиболее реакционноспособным компонентом воздуха. Сухой воздух у поверхности Земли содержит 78,1% азота, 20,9% кислорода. 0,03% углекислого газа. 1% инертных газов, но не все микроорганизмы обладают способностью ассимилировать кислород из воздуха, они потребляют кислород, растворенный в воде, питательных средах и других субстратах. Главная функция О2 состоит в том, что он служит конечным акцептором электронов при аэробном дыхании. При этом 02 восстанавливается до воды. В структурные компоненты клетки атомы кислорода включаются только в том случае, если источниками углерода служат метан, углеводороды с длинной цепью или ароматические углеводороды [2].
Изучение потребности микроорганизмов в кислороде началось с открытия Луи Пастером факта использования кислорода дрожжами для окисления источников углерода и энергии. Количественное исследование этого явления начало практически решаться в первой половине XX века с внедрением инструментальных методов контроля интенсивности дыхания и стехиометрии окисления субстрата. С середины прошлого столетия с развитием глубинного культивирования разнообразных микробов проблема обеспечения глубинных культур О2 стала одной из основных при разработке управляемого выращивания микроорганизмов [3].
При выращивании микроорганизмов в промышленных условиях обеспечение кислородом (или его удаление для анаэробов) является одним из важнейших факторов, определяющих продуктивность процесса накопления биомассы.
Потребление кислорода микроорганизмами сопровождается выделением тепловой энергии. При восстановлении микроорганизмами 1 г кислорода выделяется 14,4 кДж энергии в виде тепла. Присутствующие в питательных средах растворенные вещества (сахара, минеральные соли и др.) как правило, уменьшают растворимость кислорода. Для микроорганизмов, растущих на агаре или в тонких слоях жидкости в присутствии воздуха, кислорода обычно достаточно. В жидких средах при большом объеме жидкости аэробные микроорганизмы могут расти только на поверхности, так как в более глубоких слоях по мере удаления от поверхности условия приближаются к анаэробным. Для нормального роста аэробных микроорганизмов в глубоких слоях жидкой культуры требуется аэрация. В то время как минеральные соли и органические вещества можно добавлять в среду в концентрациях, обеспечивающих рост бактерий на протяжении нескольких часов и даже дней, с молекулярным кислородом этого сделать нельзя из-за малой растворимости в воде.
Литр воды при 20°С и нормальном атмосферном давлении содержит всего лишь 6,2 мл или 0,28 ммолей кислорода. Такого количества достаточно для окисления не более 0,046 ммолей или 8,3 мг глюкозы (т. е. примерно одной тысячной общего количества глюкозы, содержащейся в обычных питательных средах). Поэтому в среде невозможно создать значительный запас О2 и кислород приходится добавлять в жидкую среду непрерывно [3].
Для аэрации жидких культур пользуются либо обычным воздухом, либо смесью кислорода, азота и диоксида углерода. Потребление кислорода микроорганизмами зависит от индивидуальных особенностей культуры, состава среды, физиологической активности клеток, фазы развития популяции, концентрации кислорода в среде. Скорость перехода молекулярного кислорода в раствор возрастает с повышением парциального давления О2 и с увеличением поверхности раздела между газовой и жидкой фазами. Необходимость своевременного и качественного обеспечения микробных клеток кислородом при глубинном культивировании заставляет биотехнологов прибегать к разнообразным дорогостоящим ухищрениям, которые, однако, не обеспечивают во многих случаях равномерное и полноценное снабжение всей популяции микробов О2 и удаление отработанных газообразных продуктов из среды.
Авторы настоящей статьи - практические микробиологи и биотехнологи, работающие в лаборатории микробиологии биологического факультета Вятского Государственного университета, подошли к решению этой проблемы нетривиально - с позиции использования закономерностей процессов обеспечения кислородом тканей организмов с помощью крови. Была рассмотрена возможность обеспечения кислородом культивируемых микроорганизмов с помощью кровезаменителей с газотранспортной функцией на основе перфторорганических соединений (ПФОС). Для того чтобы эта идея была понятна читателям, необходимо очень коротко остановиться на истории вопроса.
Вторая половина XX века ознаменовалась широким экспериментальным поиском, медицинскими исследованиями и, наконец, внедрением в медицинскую практику большого числа кровезамещающих жидкостей, представляющих собой соединения, обладающие различными функциями. Кровезамещающие жидкости (синонимы: кровезаменители, кровезамещающие растворы, гемокорректоры) - средства, применяемые с лечебной целью в качестве заменителей или корректоров крови. Термин "кровезаменители" возник в связи с тем, что разработанные препараты обладают весьма эффективным, сопоставимым по отдельным показателям с кровью, терапевтическим действием.
Одним из важнейших направлений в трансфузиологии и разработке кровезамещающих растворов явилось создание эффективных и безопасных с медицинской точки зрения кровезаменителей с газотранспортной функцией на основе ПФОС [4].
Трудно установить, кому первому в мире пришла идея использовать фторуглеродные эмульсии как газотранспортные кровезаменители. Интенсивное их изучение для этих целей почти одновременно началось в разных странах в конце 60-х - начале 70-х годов XX столетия. В перечень основополагающих работ включают работы, принадлежащие Л. Кларку (L. Clark), Р. Гейеру (R. Geyer), Ф. Голлану (F. Gollan), Р. Наито (R. Naito), К. Якояме (К. Yokoyama) [цит. по 4].
В 1962 г. Ж. Килстра (J. Kylstra) с соавторами опубликовали статью "Мышь как рыба" [5]. В этой статье авторы отмечали, что мышь может оставаться живой, будучи погруженной в физиологический раствор, насыщаемый под повышенным давлением кислородом. Уже в 1966 г. (всего четыре года спустя) Л. Кларк (L. Clark) и Ф. Голлан (F. Gollan) обнаружили, что аналогичный эффект возможен при нормальном атмосферном давлении, если вместо воды применить жидкий перфторуглерод [6]. В 1984 году Э. М. Швирст с соавторами опубликовали результаты экспериментов со свободноплавающими в воде инфузориями-тетрахименами [7]. Эти инфузории обладают выраженным окси- или аэротаксисом. Поскольку концентрация кислорода в воде очень низка (всего около двух объемных процентов), тетрахимены периодически поднимаются к поверхностному слою на границе вода-воздух за "глотком" кислорода из воздушной среды. При этом они образуют биоконвекционные потоки, направленные от дна кюветы с водой к поверхностным слоям до границы с воздухом. Если кювету перевернуть и поместить в банку с жидким перфторуглеродом, рисунок траекторий движения инфузорий меняется. В этом случае кислород поступает в воду снизу из перфторуглерода, и инфузории не всплывают наверх, а двигаются по дну на границе раздела "вода-ПФОС". Эти эксперименты с мышами и тетрахименами показали, что различные эукариотические организмы - от инфузорий до млекопитающих - могут усваивать кислород, отдаваемый перфторуглеродами.
В нашей стране исследования в области перфторуглеродных кровезаменителей стали возможными в 70-е гг. XX столетия, когда созданная под научным руководством академика И. Л. Кнунянца школа химиков, исследующих фторированные соединения, стала искать медико-биологическое приложение своей продукции. Большую роль в направленности исследований сыграло то, что военных медиков прежде всего интересовал кровезамещающий препарат, который можно применять в условиях полевых госпиталей.
В 1979 г. в Научном центре биологических исследований в г. Пущине по инициативе и под руководством биофизика Г. Р. Иваницкого, медика Ф. Ф. Белоярцева и химика И. Л. Кнунянца началась реализация программы по разработке отечественного кровезаменителя с использованием перфторуглеродов [4]. Первая англоязычная публикация, подытоживающая выполнение главной цели данной программы, появилась в 1983 г., в которой газотранспортный перфторуглеродный кровезаменитель назван фторосаном (Ftoro-san-oxygen earring perfluorochemical plasma substitute. Beloyartcev F. F. et al. // BSC AS USSR. Pushchino). Позже название фторосан по просьбе Фармакологического комитета Минздрава СССР было заменено на перфторан, так как первоначально предложенное название кровезаменителя было созвучно названию другого фторного препарата фторотан, являющегося физиологически активным средством для ингаляционного наркоза.
С 1985 г. успешно идущие клинические испытания перфторана были остановлены, а против разработчиков препарата началась широкая негативная кампания в массовой печати. История знает немало примеров абсурдного отношения к самым гениальным разработкам. Откровенная травля в популярной прессе трагически унесла из жизни в 1985 г. одного из наиболее активных разработчиков перфторана - профессора Феликса Федоровича Белоярцева, в 1990 году умер второй из «отцов перфторана» - академик Иван Людвигович Кнунянц. Если И. Л. Кнунянц - родоначальник отечественной школы фтороргаников занялся проблемой кровезаменителей на закате своей научной карьеры, когда ему было уже более семидесяти лет и он находился в зените воздаваемых ему заслуженных почестей (лауреатом Ленинской и нескольких Государственных премий), то Ф. Ф. Белоярцеву к началу разработки перфторана в 1979 г. исполнилось только 38 лет и перфторан был его первенцем и страстью его научной жизни. Потомственный врач, автор нескольких книг по анестезиологии, участник бригады хирургов, руководимой легендарным М. Дебейки, оперировавшей президента АН СССР М. В, Келдыша. В 34 года - доктор медицинских наук, в 35 - заведующий отделением института сердечно-сосудистой хирургии им. А. Н. Бакулева, в 38 - заведующий лабораторией медицинской биофизики Института биологической физики АН СССР в г. Пущине. На его голову обрушился шквал нелепых обвинений, он столкнулся с клеветой, обысками, наговорами «больших ученых». Не выдержав травли в прессе, он покончил с собой. Исследования по доведению отечественного перфторуглеродного кровезаменителя были задержаны почти на шесть лет. История временного удушения препарата в нашей стране подробно описана в печати, в том числе и в зарубежных изданиях [8, 9].
Большая вера в свой препарат и настойчивость ученого-первооткрывателя позволили в 1990 г. Г. Р. Иваницкому и поддерживающим его сотрудникам настоять на продолжении работ и возобновлении клинических испытаний перфторана. Перфторан успешно прошел клинические испытания, в ходе которых он переливался более восьмистам пациентов. Только 22 декабря 1994 г. он был одобрен Фармкомитетом, прошел регистрацию (30 августа 1995 г.), а разработчики получили лицензию Министерства здравоохранения России на его массовое производство (21 апреля 1997 г.).
Препарат зарегистрирован как новое поколение кровезаменителей, обладающих газотранспортной функцией, улучшающих газообмен и метаболизм на уровне тканей, обладающих мембраностабилизирующей функцией, восстанавливающих гемодинамику, обладающих защитным действием на миокард и. т. п. Кроме того, ему присущи сорбционные и диуретические свойства, он улучшает динамику кровотока и периферическую микроциркуляцию крови.
В процессе создания перфторана ежегодно проводились научные конференции, поднимающие новые пласты научных данных по использованию перфторуглеродных соединений в биологии и медицине. К сожалению, в последнее десятилетие их направленность сузилась и большей мере стала клинической. По результатам конференций выпускаются тематические сборники статей, в которых отражены результаты исследований, полученные на разных этапах работы. Однако ограничение направленности исследований возможностей перфторуглеродов лишь областью медицины и созданием кровезаменителей существенно обедняет результативность и возможности их использования в биологии. Вне внимания ученых осталась такая обширная область приложения перфторуглеродов. как биотехнология. Именно в этой области, а именно при культивировании эукариотических и прокариотических микроорганизмов, являющихся источником различных биологическиактивных продуктов и обладающих более высоким обменом, чем организмы человека и животных, а, следовательно, и повышенной потребностью в кислороде, углекислом газе или анаэробных процессах, будет в ближайшее десятилетие прорыв в применении перфторуглеродов, понимании их значимости и их возможностей, что, вполне вероятно, приведет к небольшой революции в биотехнологии. Существенно сдерживает расширение областей применения перфторуглеродов то, что научная литература по соединениям этого класса и механизмам их действия является библиографической редкостью и доступна в настоящее время ограниченному кругу ученых. Следует отметить и то, что хотя по данной проблеме защищены десятки докторских и кандидатских диссертаций, но все они близки к трансфузиологии, трансплантологии и в целом к лечебной медицине, и весьма далеки от фундаментальных проблем биотехнологии.
В апреле 1992 г. независимые эксперты Фармацевтической корпорации Альянс (Pharm. Corp. Alliance, San Diego. USA) всесторонне исследовали перфторан. Были проверены все его параметры и дополнительно изучены пульмонологические эффекты, выраженность реакций крови и кинетика изменения температуры тела животных после введения препарата. В заключении на проведенные испытания вице-президент фирмы С. Файтфул отметил хорошие качества препарата.
Большую работу в продвижении перфторуглеродов в различные области науки и практики проделали создатели перфторана и их последователи. В первую очередь это относится к деятельности члена-корреспондента РАН, президента ОАО НПФ «Перфторан» Г. Р. Иваницкого и директора НИИ общей реаниматологии, члена-корреспондента РАМН В. В. Мороза, являющегося вице-президентом ОАО НПФ «Перфторан». Издаваемые под их общей редакцией практические ежегодные сборники научных трудов "Перфторорганические соединения в биологии и медицине" оказывают неоценимую помощь в распространении знаний и популяризации достижений по данной проблеме. Именно из этих сборников почерпнута большая часть информации по перфторуглеродам. использованная в настоящей статье. Большая заслуга этих ученых состоит и в продвижении достижений российских ученых, связанных с перфторуглеродами. за пределы нашей страны.
В сентябре 1997 г. в Пекине состоялся «Двенадцатый международный конгресс по искусственным клеткам, кровезаменителям и иммобилизованной биотехнологии». Россию на этом конгрессе представляли создатель перфторана Г. Р. Иваницкий и В. В. Мороз. В день открытия на пленарном заседании они показали специально подготовленный к конгрессу фильм "Русский перфторан. Что это такое?". Поразительно было то, что участники конгресса в своей массе не знали, что в России с 1990 г. были возобновлены работы по созданию и клиническому изучению перфторуглеродных кровезаменителей, поэтому сообщение о наличии русского коммерческого препарата, к тому же превосходящего по своим характеристикам японский флюозол, было сенсацией. Сидящие в зале еще помнили статью В. Рич (V. Rich) «Скандал вокруг советского исследовательского проекта по искусственной крови», опубликованную в журнале "Nature" в 1988 г., и считали, что русские потерпели фиаско в своем проекте [8]. И вдруг представители России сообщают, что перфторан прошел все клинические испытания, имеет разрешительные документы Фармкомитета и Минздрава России, продается в аптечной сети и используется в клиниках. Г. Р. Иваницкий пишет: "Сначала в зале царили недоверие и скепсис. Однако после ответов на многочисленные вопросы они сменились на повышенный интерес к данной теме. Долго пришлось объяснять, как путем отбора пефторуглеродов и поиска их пропорций удалось избавиться от недостатков, имеющих место в японском препарате. Слушателей поразила и сравнительно низкая цена перфторана - 200 долларов за дозу в 400 мл. Японский препарат почти в 2раза дороже. Цена перфторана даже ниже, чем в США цена проверенной на инфекции донорской крови. Однако для отечественного рынка на фоне наших ежегодных нищих бюджетов, отпускаемых на здравоохранение, стоимость препарата выглядит внушительной. Его цена не связана с монополией на производство. Высокие энергоемкие технологии и дорогое сырье - вот причина такой цены" [цит. по 4].
И следует вновь обратить внимание на то, что исследования перфторуглеродов только с точки зрения создания кровезаменителей, существенно обедняет результативность и возможности их использования в биотехнологии. Достойное применение перфторуглероды уже находят при производстве косметических средств. Так, производитель целого комплекса косметических препаратов компания Faberlic включает в них, кроме эксклюзивных биологически активных добавок, уникальную эмульсию «Аквафтем», которая представляет собой эмульгированные перфторуглероды, обеспечивающие доставку молекулярного кислорода в глубокие слои кожи. Компания Faberlic обладает эксклюзивным патентом на это современное изобретение российских ученых [10].
Нами было проведено культивирование микроорганизмов-прокариотов, относящихся к энтеробактериям, псевдомонадам, бациллам, актиномицетам, цианобактериям, аэромонадам, ярровиям, родококкам, и эукариотов, относящихся к простейшим и микромицетам, при этом было показано, что добавление в среду ПФОС с газотранспортной функцией значительно ускоряет рост и развитие микроорганизмов, а также продукцию ими биологически активных веществ.
Экспериментально показано, что окисленные соединения углерода в присутствии перфтордекалина микроорганизмы ассимилируют с гораздо меньшим потреблением кислорода, чем восстановленные. При культивировании дрожжей на глюкозе потребность в кислороде составляет не более 0,8 г на грамм абсолютной сухой массы (АСБ), при ассимиляции органических кислот - до 2,2 г, жидких углеводородов - до 3,2 г на грамм АСБ.
С помощью перфторуглеродов. обладающих газотранспортной функцией, возможно решение общих и частных вопросов микробиологического синтеза биологически активных веществ, создания новых систем микробиологической деградации экотоксикантов, производства разнообразных препаратов: белков, витаминов, ферментов, спиртов, органических кислот, антибиотиков; разработки новых технологий применения микроорганизмов в различных областях промышленности: пищевой (при получении продуктов питания); медицинской (при получении иммунобиологических препаратов, вакцин, диагностикумов, эубиотиков, гормонов и др.); энергетической (при создании новых источников удобных, экономически выгодных и экологически чистых видов топлива); химической (биосинтез и модификация химических веществ); электронной (создание биоэлектронных датчиков и сенсоров).
Большинство микроорганизмов, используемых в биотехнологии получения практически полезных продуктов, улучшения свойств почвы и используемых человеком для охраны окружающей среды, нуждаются для роста, развития и продукции биологически активных веществ в молекулярном кислороде. В процессе аэробного дыхания микроорганизмы окисляют питательные субстраты до простых соединений, двуокиси углерода и воды.
Не надо быть большим пророком, чтобы предсказать, что именно в области биотехнологии, основанной на культивировании культур микроорганизмов, клеток и тканей в ближайшее десятилетие произойдет прорыв в применении перфторугперодов. На наш взгляд, биотехнология стоит на пороге прорыва и цепной реакции в расширении направлений и областей использования ПФОС. Спрос для биотехнологии на ПФОС ввиду их уникальных газотранспортных свойств в ближайшие годы должен возрасти в десятки и сотни раз. Тем более удивительно, что на состоявшемся в октябре 2002 г. в Москве 1-ом Международном конгрессе "Биотехнология: состояние и перспективы развития" не было докладов, посвященных вопросу применения перфторуглеродов в биотехнологии [11]. Хочется верить, что на следующем конгрессе, который должен состояться 14-17 октября 2003 г., таких докладов должно быть не меньше десятка.
Литература:
1. Большая медицинская энциклопедия. - М.: Сов. Энциклопедия, 1980. Т.12. С. 93-132.
2. Егоров Н. С. Промышленная микробиология. - М.: Высшая школа, 1989. - 688 с.
3. Шлегель Г. Г. Общая микробиология. - М.: Мир, 1987. - 568 с.
4. Иваницкий Г. Р. // Перфторорганические соединения в биологии и медицине. - Пущино: ПНЦ РАН, 2001, Вып. XI. С. 4-48.
5. Kylstra J. A., Tissing М. 0., Van der Maen A. // Trans. Am. Soc. Artificial Internal Organs. 1962, V. 8. P. 378,
6. Clare L. C., Gollan F. // Sciens. 1966. V. 152. № 3730. P. 1755-1756.
7. Швирст Э. М., Кринский В. И., Иваницкий Г. Р. // Биофизика. 1984. Т. 34. Вып. 4. С. 649-653.
8. Физиологически активные вещества на основе перфторуглеродов в экспериментальной и клинической медицине. Под ред. Г.А. Сафронова /Тез. науч. конф. 19-20 июня 2001 г. Санкт-Петербург: ВМА, 2001.129с.
9. Rich V. // Nature. 1988. V. 335. № 6186. P. 107.
10. Faberlic кислородная косметика. Каталог компании Faberlic. 2002. 40 с.
11. Биотехнология: состояние и перспективы развития. Материалы 1-го Международного Конгресса. Москва, 14-18 октября 2002 г. - М.: ЗАО "Максима", РХТУ им Д. И. Менделеева, 2002. - 544 с.
Д. м. н.. Профессор Бакулин М. К.:
к. б, н., доцент Кучеренко А, С.:
д. м, н., профессор Золотарев А. Г.:
н. с. Кривошейка Н. А.:
Лаборатория микробиологии Вятского Государственного университета
