Требования к поверхности субстрата. Большинство нетрансформи-
рованных клеток млекопитающих могут расти только в виде монослоя,
будучи прикрепленными к субстрату: к другим клеткам либо к стеклу
(алюмоборосиликатное стекло, чаще модифицированное), пластику (по-
листирол, полиэтилен, поликарбонат, поливинилхлорид, тефлон, целло-
фан и другие при условии правильной обработки этих полимеров – пла-
стиковая поверхность должна быть специально обработана, чтобы клет-
ки могли к ней прикрепиться, причем клетки эукариот не прикрепляются
к пластиковым чашкам, предназначенным для бактериальных культур)
или металлу (качественная нержавеющая сталь или титан).
Поверхности клеток животных и поверхности традиционных культу-
ральных сосудов из стекла и пластика, обладающие высокой поверхно-
стной энергией, несут отрицательные заряды. Поэтому для прикрепления
клеток необходимо образование поперечных сшивок с гликопротеинами
(наиболее изученным является фибронектин, присутствующий в сыво-
ротке и других физиологических жидкостях), а также присутствие двух-
валентных катионов кальция и магния. Суммарный отрицательный заряд
поверхности субстрата (например, за счет образования отрицательно за-
ряженных карбоксильных групп) может достигаться предварительным
воздействием химическими (окисляющие агенты) и физическими факто-
рами (высоковольтный разряд, облучение УФ), что облегчает электро-
статическое прикрепление клеток. Поверхность культурального сосуда
может быть также покрыта веществом, облегчающим прикрепление кле-
ток. К природным субстратам, на которых растут клетки, относятся
коллаген и желатин. Для этих целей используют коммерческие
препараты коллагена для культуры тканей (например, «Витроген 100»),
что позволяет избежать утомительной процедуры получения коллагена
из крысиных хвостов.
Культуральная посуда. Монослойное культивирование осуществ-
ляют во флаконах (флаконы Ру – самые большие стационарные флаконы
поверхностью до 200 см2) или пробирках для культуры тканей, обеспе-
чивающих поверхность роста 5−200 см2.
Рост клеток в монослое. В случае монослойных культур необходи-
мо проводить систематические пассажи клеток, используя для этого
культуры предыдущего рассева или музейные клетки, сохранившиеся в
условиях консервации. Полноценная популяция может быть получена
только от генерации, состоящей из жизнеспособных клеток. Поэтому
просмотр и оценка качества монослоя имеют решающее значение при
выборе культур для пересева. 55
Первичные клетки, которые делятся в культуре, могут претерпевать
так называемое контактное торможение движения. Когда две клетки
приближаются друг к другу, то в зоне контакта прекращаются специфи-
ческие движения клеточной мембраны. Первичные клетки, следователь-
но, не могут расти друг над другом, и в большинстве случаев достижение
полного монослоя сопровождается прекращением клеточных делений.
Этот феномен характерен не только для первичных клеток, но наблюда-
ется также во многих клеточных линиях. Нетрансформированные клетки
могут в течение некоторого времени сохранять жизнеспособность в та-
ком покоящемся состоянии, но если их не пересеять, они погибают. Из
сыворотки было выделено несколько факторов, обладающих способно-
стью снимать контактное торможение.
Снижение распластывания клеток при достижении полного моно-
слоя, а также ошаривание и прекращение роста клеток при их открепле-
нии от подложки легли в основу представлений о тесной связи распла-
стывания нетрансформированных клеток по мере их роста.
Ослабленным контактным торможением характеризуются клетки,
трансформированные вирусами, и такие клетки могут достигать более
высокой конечной плотности. Считается, что эти клетки утрачивают за-
висящую от плотности регуляцию. Трансформированные клетки способ-
ны расти вплоть до полного истощения среды, и если после этого не на-
ступает смена среды, то клетки быстро погибают.
Одним из факторов, лимитирующим рост клеток, является истощение
в среде необходимых питательных компонентов. Следовательно, для по-
лучения высокой плотности клеток необходима периодическая замена
питательной среды, а это может приводить к постоянному изменению
состава среды, омывающей клетки, что весьма нежелательно.
Процесс подготовки клеточного монослоя к отделению от стекла и
формированию суспензии (обработка клеток в монослое 0,02 % раство-
ром химопсина в фосфатно-солевом буфере или 0,1 % трипсином и
0,01 % ЭДТА) происходит при комнатной температуре в течение
5−10 мин в зависимости от типа культуры и ее индивидуального состоя-
ния. Как только клеточный монослой достаточно разрыхляется и начина-
ет отделяться от стекла, раствор фермента сливают, а в культуральную
посуду заливают определенное количество ростовой среды. Этой средой
тщательно смывают клетки со стенки сосуда и легким пипетированием
способствуют образованию гомогенной взвеси. Полученную взвесь по-
сле подсчета числа клеток разводят ростовой средой до посевной дозы и
используют при новых пересевах. 56
Монослойные культуры имеют ряд преимуществ, являющихся пред-
посылками их широкого использования:
1) выделение секретируемого продукта многими клетками осуществ-
ляется эффективнее в случае их прикрепления к субстрату;
2) возможность быстрой и легкой замены питательной среды, сопос-
тавления времени и количества среды с периодом роста клеток или вре-
менем наработки продукта;
3) обеспечение наибольшей гибкости исследований, поскольку в мо-
нослой могут быть введены любые типы клеток;
4) достижение искусственно высокой плотности клеток с использо-
ванием перфузионной техники;
5) возможность использования одной и той же аппаратуры с разным
отношением клетки-среда, легко изменяемым в ходе эксперимента.
Однако при использовании монослойных культут выявляются и не-
достатки:
1) сложность масштабирования;
2) отсутствие информативности визуального анализа;
3) трудности с определением и поддержанием таких параметров, как
кислотность и содержание О2, и обеспечением гомогенности культуры
клеток;
4) необходимость значительных пространств.
