Клонирование в клетках Bacillus subtilis.

Эти Г+ бактерии изучены достаточно хорошо. Они имеют относительно просто устроенную клеточную стенку со слабо выраженным ??????. Представители рода могут образовывать и выделять в окружающую среду многие БАВ – ферменты, антибиотики. В их хромосомах картировано ок. 350 различных генов. Рекомбинантная ДНК м. б. относительно просто введена в клетки в результате процессов трансформации. Ограничивает использование этих бактерий в генной инженерии отсутствие собственных плазмид, а те которые известны – криптические – не имеют фенотипических признаков. Поэтому в качестве векторов используются плазмиды др. Г+ бактерий - стафилококков, стрептококков. Это плазмиды pC194, puB110. эти плазмиды небольшого размера, что делает возможным клонирования в их составе относительно крупных фрагментов чужеродной ДНК. Они мультикопийные (в клетке м. б. до 50 копий этих плазмид). Они относительно просто вводятся в клетку.

С использованием плазмид pC194 b(Г+) + pBr322 (Г-) - был сконструирован первый челночный вектор. Он мог наследоваться и в клетках Bacillus, и в клетках E. Coli.

Для Bacillus были сконструированы секретирующие векторы. Их генные продукты могли удаляться из клетки. Был использован следующий подход: ген, который необходимо клонировать и его продукт, который необходимо выделить из клетки, помещали под нуклеотидную последовательность, которая соответствует так называемому сигнальному белку. Такой сигнальный белок располагался на N-концевом участке белковой молекулы и обеспечивал прохождение белкового продукта ч/з цитоплазматическую мембрану. В ней данная сигнальная последовательность отщеплялась, а белок секретировался из клетки, что существенно облегчало его последующее выделение.

ЦПМ продукт

↓ ↓

Такие сигнальные последовательности есть не у всех белков. Для BS – амилаза; для Г- - используется сигнальная последовательность из фермента β-лактомазы.