в естественных условиях обитания чистые культуры м/о встречаются довольно редко. Поэтому для работы необходимо искусственное выделение чистых культур. Для этого обычно требуется не более 2-3 суток. Но для некоторых м/о микобактерии туберкулеза) этот процесс может затянуться на 4-6 недель.
Чистые культуры м/о – популяция бактерий одного вида, представляющая потомство одной клетки.
Выделение чистой культуры делят на 3 этапа.
1. Получение накопительной культуры.
Накопительная стадия дает возможность накопить требуемый м/о в достаточном количестве. Это достигается за счет создания благоприятных условий для его роста и выживания в сравнении с др. членами популяции.
Физические методы. Это регуляция роста t, тепловой и ультразвуковой обработкой, УФ облучением и др. Можно использовать физиологические особенности данного организма, подвижность, размеры, что позволяет отделить его от др. членов популяции.
Ø Получение накопительной культуры бактерий, обладающих скользящим типом движения. Пробы предварительно разведенного исследуемого биологического материала засевают петлей в конденсационную воду скошенной агаризованной питательной среды в пробирках. Посевы инкубируют при оптимальной t. Клетки, характеризующиеся скользящим типом движения, поднимаются по поверхности среды и разрастаются далеко за зону населения посевного материала.
Ø Использование освещения для получения культур цианобактерий. Такие виды выделяются и в пресной воде, и в морских осадках. Условия инкубации: t 250С, освещение 500-3000 лк. Ч/з 4-7 дней наблюдается увеличение мутности культуры, имеющей часто розовую, коричневую, желтую окраску.
Ø Инкубация при низкой температуре для получения культур психрофильных бактерий. Инкубация при t 0-50С в течение 14-24 дней. Многие бактерии в таких условиях не растут или погибают.
Химические методы. Используются токсические в-ва, которые убивают или подавляют рост оставшейся части популяции, не влияя на выделяемый организм.
Ø Условия инкубирования в кислой среде для выделенных культур лактобацилл. Для выделения бактерий из сыров высев производится на среду, которая за счет ацетатной буферной системы имеет рН 5,3. В этом случае Lactobacillus casei, L. Plantarum способны образовывать колонии, а др. молочнокислые бактерии – нет.
Ø Ингибирование роста пенициллином для получения культур микоплазм. Т. к. микоплазмы не имеют клеточной стенки, они устойчивы к высоким концентрациям пенициллина, который подавляет рост бактерий с клеточной стенкой.
Ø Разбавленная среда для получения культур Sphaerothilus. Бактерии данного рода, образующие чехлы, встречаются в загрязненных сточных водах, открытых водоемах, где образуют слизистые «пряди», прикрепленные к погруженным в воду предметам. Получение накопительных структур основано на их способности к росту при низком содержании питательных в-в. питательную среду разбавляют водой. В течение 2-5 дней инкубирования проводят микроскопический контроль образования нитей. Для получения чистой культуры проводят рассев пленки на твердую среду.
Ø Целлюлоза как субстрат для цитофаг. Цитофаги разлагают целлюлозу, поэтому на поверхность основного минерального агара помещают кусочки фильтровальной бумаги. На бумагу кладут частицы почвы или растительного материала и инкубируют чашки при комнатной температуре. Следят за образованием вокруг частиц желтой, оранжевой или розовой окраски, а также процессом лизиса бумаги.
Ø Бактериальные клетки как субстрат для миксобактерий. Некоторые виды миксобактерий способны с помощью литических бактерий лизировать клетки др. бактерий и использовать продукты лизиса для своих целей. Бактериальные клетки (субстрат) используют в виде густой суспензии ,которую наносят мазком на поверхность водно-агаровой среды. На один конец мазка помещают 2-3 частицы почвы или кусочки растительного материала. Ч/з 2-5 дней исследуют чашки для анализа растворения бактериального мазка вокруг добавленных частиц. При обнаружении по его краям желтых, оранжевых или розовых плодовых тел их переносят на питательную среду.
Биологические методы. Использование для выделения м/о организм хозяин.
Ø Получение накопительной культуры патогенных для животных организмов. Животное-хозяин инфицируют смешанной культурой с патогенным м/о, а затем выделяют его из крови и тканей. При этом в результате действия иммунной системы животного сопутствующие непатогенные организмы ингибируются и гибнут. Чистую культуру пневмококков получают введением внутрибрюшинно мыши 1 мл эмульгированной мокроты с S. Pneumoniae и др. м/о, ч/з 4-6 часов. Пробы перитонеальной жидкости берут из брюшной полости животного стерильной капиллярной пипеткой.
Ø Бактериальный паразитизм бделловибрионов. Способность бделловибиронов прикрепляться к Г – бактериям, проникать ч/з их клеточную стенку и размножаться в периплазматическом пространстве с последующим лизисом бактерий используется таким образом. Надосадочную жидкость, полученную в результате центрифугирования растворенной в воде почвы, пропускают ч/з мембранные фильтры с D до 0,45 мкм. Полученный фильтрат смешивают с суспензией клеток-хозяев. В составе полужидкой питательной среды смесь наслаивают на поверхность агаризованной среды в чашках Петри. После инкубации (18-24 часа) проверяют появление зон лизиса. Области лизиса вырезают из агара и наслаивают на газон чувствительной культуры.
Ø Симбиоз растений с Rhizobium. Клубеньки бобовых – это природная накопительная культура симбиотических азотфиксирующих бактерий. Корни с клубеньками промывают, поверхностно стерилизуют (используя сулему, этанол), помещают в воду, раздавливают пинцетом в одной чашке Петри. 1-2 петли такой суспензии переносят в следующую чашку и т. д. К каждому разведению добавляют расплавленный и остуженный агар с маннитом. После застывания агара чашки инкубируют при оптимальной температуре.
2. Выделение чистой культуры.
Используется метод изолирования отдельных клеток на твердой питательной среде посевом штрихом или разливом по чашкам небольшого количества жидкой культуры (метод предельных разведений). Но получение отдельной колонии не всегда гарантирует чистоту культуры, т. к. колони могут вырасти из скоплений разных видов. Если м/о образуют слизь, то часто к ней прикрепляются посторонние формы. Для очистки предпочтительно использовать неселективную среду, т. к. на ней лучше растут контаминирующие м/о и их легче обнаружить.
Получение изолированных колоний на твердой питательной среде достигается либо путем рассева взвеси м/о шпателем (метод Коха), либо с помощью бактериологической петли (метод истощающего штриха). В результате механического разобщения клеток м/о каждая из них может дать начало изолированной колонии одного вида микробов.
Рассев шпателем (метод Коха):
Ø На поверхность питательной среды в чашке №1 наносят стерильной пипеткой каплю накопительной культуры и распределяют ее стерильным шпателем;
Ø Чашку № 1 закрывают, а шпатель переносят в чашку №2 не стерилизуя его. Имитируют распределение культуры по всей поверхности среды, прикасаясь к ее поверхности той же стороной шпателя, которой ранее распределяли пробу;
Ø Тоже в чашке № 3. после чего шпатель стерилизуют;
Ø Чашки помещают в термостат и инкубируют при оптимальной t;
Ø Ч/з определенное время чашки достают из термостата и изучают рост м/о. Обычно в чашке №1 наблюдается сплошной рост, в №№ 2,3… - формируются изолированные культуры.
Рассев петлей (метод истощающего штриха):
На агаризированную среду в чашки Петри бактериологической петлей идет высев из накопительной культуры. На 1-м этапе петлей с культурой наносят ряд параллельных штрихов. Петлю стерилизуют, остужают и проводят ряд штрихов перпендикулярно первым. 3-й перпендикулярно 2-м, 4-й – 3-м. Чашки помещают в термостат и ч/з определенное время учитывают результат. Обычно на 1-2 серии штрихов наблюдается большое число колоний, а на 3-4 – изолированные.
Последовательные разведения в твердой среде.
После инокуляции пробы в пробирку со стерильным расплавленным и охлажденным агаром среду перемешивают, выливают в чашку Петри и дают застыть. Для получения хорошо изолированных колоний готовят ряд последовательных десятикратных разведений и по 1 мл проб вносят сразу в чашку, добавляют 15-20 мл среды, перемешивают покачиванием. Иногда отдельные колонии остаются погруженными в агар и их извлекают механически. Плохо и то, что бактерии некоторое время находятся в среде при t расплавленного агара.
Физические методы. Это регуляция роста t, тепловой и ультразвуковой обработкой, УФ облучением и др. Можно использовать физиологические особенности данного организма, подвижность, размеры, что позволяет отделить его от др. членов популяции.