При прохождении белого света с интенсивностью I0 через прозрачный стеклянный сосуд, заполненный раствором, происходит ослабление этого света. Выходящий свет будет иметь другую, меньшую, интенсивность I. Ослабление светового потока связано, в основном, с поглощением световой энергии раствором.
В практике аналитической химии и биохимии не определяют абсолютные фотометрические величины I0 и I исследуемого раствора, а измеряют их по отношению к фотометрическим величинам другого раствора сравнения (стандарта, холостой пробы) с известными параметрами и налитого в точно такой же сосуд, как и исследуемый раствор.
Интенсивность окраски в колориметрии выражают величиной оптической плотности D.
Связь между интенсивностями падающего светового потока I0 и светового потока I, прошедшего через окрашенный раствор, устанавливается законом Бугера-Ламберта.
Таким образом, оптическая плотность D есть мера непрозрачности вещества толщиной для оптического излучения. Оптическая плотность характеризует ослабление оптического излучения в слоях различных веществ (красителях, светофильтрах, растворах, газах и т. д.).
Оптическая плотность не зависит от площади поперечного сечения падающего на слой вещества светового потока, она зависит только от толщины поглощающего слоя, концентрации поглощающего вещества и поглощающей способности вещества.
Окраска раствора обусловлена неодинаковым поглощением молекулами растворенного вещества оптических колебаний разных длин волн. Максимум светопоглощения многих окрашенных веществ лежит в видимой области спектра. Цвет раствора определяется длиной волны .max, соответствующей максимуму светопоглощения. Интенсивность окраски определяется степенью поглощения, а «чистота» - шириной «пика» спектральной кривой поглощения.
Основной закон колориметрии строго выполняется лишь при прохождении монохроматического света, но во многих случаях при применении сложного (полихроматического) излучения, отклонение от закона Бера можно минимизировать, используя монохроматоры или светофильтры для сужения спектра светового излучения.
В визуальных методах человеческий глаз оценивает окраску исследуемого образца путем сравнения со стандартом. Визуальные методы относятся к колориметрическим методам (колориметрия – измерение цвета).
В методе цветовой шкалы приготавливают серию стандартных растворов с различной концентрацией вещества (с различной окраской растворов). Для этого проводят цветную реакцию вещества с известной максимальной концентрацией в нескольких пробирках. Затем добавляют в пробирки различное количество воды, разбавляя цветные растворы до различных концентраций вещества (интенсивностей цвета). Для исследуемого образца вещества проводят цветную реакцию и определяют концентрацию, сравнивая цвет полученного раствора с цветами стандартных растворов. Данный способ широко используется при полуколичественной оценке содержания ряда метаболитов в моче с помощью тест-полосок, когда окраска тест-полоски сравнивается с цветной шкалой, нанесенной на тубу.
В методе разбавления исследуемый и стандартный (с известной концентрацией) растворы (примерно одинаковой концентрации) наливают в прозрачные градуированные пробирки. Наблюдая окраску добавляют растворитель в пробирку с более окрашенным раствором до тех пор, пока цвета пробирок, то есть концентрации, не уравняются.
Метод уравнивания интенсивности окраски состоит в сравнении стандартного и испытуемого растворов разной толщины. Для этого наливают эти растворы в стеклянные цилиндры с плоскими доньями и наблюдают окраску сверху сквозь толщу растворов и, сливая более интенсивно окрашенный раствор, добиваются одинаковой интенсивности окраски в обоих цилиндрах. Уравнивание световых потоков можно достигнуть также в методе диафрагм или оптического клина, сравнивая интенсивность окраски раствора с экраном с подходящей окраской.
Освещенность экрана изменяется при изменении ширины диафрагмы, которая имеет соответствующую шкалу. Вместо диафрагмы можно использовать стеклянный световой клин, у которого интенсивность окраски зависит от участка клина. Перемещая клин вдоль диафрагмы максимально размера, добиваются совпадения окраски раствора и экрана.
В связи с индивидуальными, неповторяющимися свойствами глаза, визуальные измерения субъективны и характеризуются относительно большой ошибкой. Человеческий глаз довольно быстро устает, поэтому при выполнении больших серий визуальных определений точность измерения непрерывно уменьшается. Кроме того, производительность таких исследований крайне мала. Несоответствие визуальных методов современным требованиям к точности биомедицинских измерений привело к их вытеснению из медицинской практики фотоэлектрическими методами.
