Технология работы со съемными рецепторными чипами

Технология измерений, предусматривающая установку проточной ячейки на чувствительную поверхность оптической призмы, описанная в предыдущей лекции и удобная для научных исследований, не очень пригодна для массовых анализов. Для того, чтобы стала возможной более продуктивная технология, тонкую золотую пленку и чувствительный рецепторный слой наносят не непосредственно на поверхность призмы, а на отдельные прозрачные пластинки. Такую пластинку называют " съемным рецепторным чипом ".

Схема простейшего плоскопараллельного съемного рецепторного чипа показана на рис. 24.4. Основой его является стеклянная плоскопараллельная пластина 1 толщиной 0,5...1 мм из стекла с высоким показателем преломления.

Рис. 24.4. Схема простейшего рецепторного чипа

На поверхность стеклянной пластины 1 нанесена тонкая металлическая пленка 2. На ней сформирован специфически чувствительный рецепторный слой 3, который называют "чувствительной" ("активной", "рабочей") поверхностью.

Отдельные рецепторные чипы, будучи съёмными, позволяют применить групповые процессы отмывания и восстановления (регенерации) слоя лиганда. Ведь одновременно могут обрабатываться десятки, сотни таких чипов. Это значительно уменьшает затраты специальных реактивов, повышает производительность процесса регенерации и тем самым удешевляет эти процедуры. Промывание и восстановление чувствительной поверхности отделяются от процесса измерения.

Проведя измерение, рецепторный чип вынимают из прибора, а на его место устанавливают другой. При проведении массовых анализов, когда не требуется снимать сенсограмму, а надо лишь обнаружить наличие аналита или определить его концентрацию, из цикла измерения можно исключить не только отмывание, но также и время, требуемое для взаимодействия аналита с лигандом. Ведь исследуемая жидкость может быть нанесена на чувствительную поверхность рецепторного чипа заблаговременно и выдержана на ней вне прибора в течение нужного времени. И лишь "созревший" рецепторный чип с пробой устанавливают в прибор для измерения. Благодаря этому измерения выполняют одно за другим значительно производительнее.

Изготовление рецепторных чипов, их отмывание и регенерацию рецепторного слоя целесообразно выполнять в специальных биохимических лабораториях. Массовые пользователи этим сами не будут заниматься. Для анализов они получат в лаборатории нужное им количество готовых проверенных рецепторных чипов, и после проведения анализов будут возвращать использованные рецепторные чипы снова в лабораторию. Это немного похоже на специально оснащенные фотолаборатории, куда пользователи сдают экспонированные фотопленки и спустя некоторое время получают профессионально обработанные негативы, слайды или фотографии.

Когда рецепторный чип отработает свое время, он утилизируется. А сам ППР сенсор, его оптоэлектроника продолжают работать с другими рецепторными чипами. Его стоимость переносится в таком случае на значительно большее количество анализов, что тоже заметно удешевляет их.

Чтобы обеспечить надежный оптический контакт между призмой и подложкой рецепторного чипа, между ними наносят соответствующую иммерсионную жидкость. Оптимальной ситуацией теоретически является такая, когда и основа рецепторного чипа, и стекло оптической призмы, и иммерсионная жидкость между ними имеют точно одинаковый показатель преломления. Однако такая ситуация не реалистична. Поэтому рассмотрим общий случай, когда все три указанных среды имеют несколько разные показатели преломления.

Схема прохождения лучей света через оптическую структуру "призма – иммерсионная жидкость – подложка рецепторного чипа" показана на рис. 24.5. Рассматривается оптимальный вариант, когда .

Рис. 24.5. Схема преломления и отражения света от границ раздела сред

В этой структуре имеются две границы раздела сред: 1 – между призмой и иммерсионной жидкостью, 2 – между иммерсионной жидкостью и стеклянной подложкой рецепторного чипа.

Закон преломления света записывается для данного случая так:

Чтобы угол не превышал 80 (когда , работа сенсора может стать неустойчивой), должно выполняться условие

При типичных значениях и это сводится к следующему условию для показателя преломления призмы . Его нетрудно выполнить.

На оптической схеме рис. 24.5 нетрудно видеть, что отраженный от границ раздела свет распространяется параллельно свету, отраженному от рабочей области рецепторного чипа, и поэтому тоже попадает на фотоприёмник. Этот отраженный свет создает вредный фоновый сигнал, который не зависит от коэффициента отражения от пленки металла и может существенно уменьшить глубину минимума ППР. Для оценки величины фонового отражения от границ раздела оптических сред сделаем расчеты с использованием известных формул Френеля, Для коэффициента отражения -поляризованного света от границы раздела двух оптических сред имеем:

где – угол падения света на границу раздела сред; – угол преломления света.

Расчеты коэффициентов отражения дают для разных значений = 1,47; 1,49; 1,51; 1,53 и 1,55 результаты, приведенные в табл. 24.2.

Для ППР сенсоров, работающих с параллельным пучком света, хорошим способом борьбы с засветкой фотоприемника светом, отраженным от границ раздела оптических сред, может стать следующий приём. Если съёмные рецепторные чипы формировать не на плоскопараллельных пластинках стекла, а на пластинках с небольшой клиновидностью, то отраженный от границ раздела свет будет распространяться в направлении, не совпадающем с направлением распространения света, отраженного от рабочей области рецепторного чипа. Поэтому "паразитный" свет можно диафрагмировать так, чтобы он не попадал на фотоприемник и не мешал наблюдению ППР.

Экспериментально найдено, что нанесенная на рабочую поверхность призмы капля иммерсионной жидкости при установке съемного рецепторного чипа растекается до толщины не больше 10 мкм. При такой толщине прослойки существенными становятся капиллярные силы сцепления. Они определяют величину усилий, необходимых при снятии рецепторного чипа с рабочей поверхности призмы. При снятии чипа путем сдвига для иммерсионных жидкостей с низкой вязкостью (например, ?–монобромнафталин) сила сдвига составляет несколько граммов. При снятии чипа путем отрыва требуемое усилие существенно больше и увеличивается с ростом вязкости жидкости, величины и продолжительности внешней нагрузки на пластину. Оно может составлять 0,1 0,5 кгс/см². Для иммерсионных жидкостей с низкой вязкостью такая зависимость оказывается значительно слабее. При отсутствии внешней нагрузки сила отрыва составляет 0,025 0,1 кгс/см².

Обратим внимание также на то, что в условиях обычных помещений и в полевых условиях съемные рецепторные чипы из-за наличия пыли не так просто каждый раз установить точно в одно и то же положение относительно падающего пучка света. На рис. 24.6 схематически показано расположение рецепторного чипа 2 на поверхности оптической призмы 1.

Рис. 24.6. Взаимное расположение поверхности призмы 1 и съемного рецепторного чипа 2; 3 – иммерсионная жидкость; 4 – посторонняя пылинка

Тонкий слой иммерсионной жидкости 3 обеспечивает требуемый оптический контакт между ними. Если в слой иммерсионной жидкости 3 случайно попадает посторонняя пылинка 4, то рецепторный чип 2 располагается уже не точно параллельно поверхности призмы, а разворачивается относительно нее на небольшой угол

где – размер пылинки, – длина рецепторного чипа. Например, при = 0,1 мм и = 20 мм этот случайный неконтролируемый угол наклона составляет приблизительно 0,3 . Для ППР сенсоров это существенно, поскольку случайный угол отклонения в ориентации чипа ограничивает порог чувствительности. Поэтому, когда измерения должны проводиться не в стерильно чистых лабораторных, а в обычных и, тем более, в полевых условиях, когда наличие таких пылинок устранить практически невозможно, с этим фактором приходится считаться.

Один из возможных способов борьбы с влиянием пылинок показан на рис. 24.7.

Рис. 24.7. Выемка 3 на поверхности призмы 1 как один из способов уменьшения влияния пылинок (2 - рецепторный чип; 4 – иммерсионная жидкость)

В той области поверхности призмы 1, где должен устанавливаться рецепторный чип 2, сделана хорошо отполированная выемка 3 глубиной 1-2 мм, которую во время работы заполняют иммерсионной жидкостью 4.

Площадь контакта рецепторного чипа непосредственно с поверхностью призмы уменьшается в десятки раз. И пропорционально уменьшается вероятность попадания между ними пылинки. Если же пылинка попадает не на контакт, а на поверхность выемки, то остается внутри иммерсионной жидкости и не может изменить положение рецепторного чипа.

Тем не менее, в более точных ППР сенсорах, когда при проведении анализов надо регистрировать очень малые сдвиги угла ППР от 0,01 до 0,001 , таких предупредительных мер недостаточно.

Одна из оптоэлектронных схем, которая позволяет решить задачу точной автоматической ориентации рецепторного чипа, показана на рис. 24.8. Рецепторные чипы 1 изготовляют здесь в виде небольших планарных стеклянных призм с такими углами при основе, которые обеспечивают нужный угол падения ?0. Чувствительную поверхность 2 (золотая пленка + лиганд) формируют на верхней грани призмы. Перед выполнением анализа именно на нее надо наносить каплю исследуемой жидкости 3.

Рис. 24.8. Принципиальная схема ППР сенсора с автоматической ориентацией рецепторного чипа

Съемный рецепторный чип 1 устанавливают на опорную основу 4. Угол сделанной в ней выемки несколько больше угла при вершине призмы. В основу 4 вмонтированы пружина 5 и узел микроперемещения 6, которые фиксируют рецепторный чип 1 в определенном положении. Когда на верхнюю грань чипа 1 падает рассеянный внешний свет, то, входя в стекло, он преломляется и распространяется дальше под углами к нормали, которые не превышают предельный угол. Падая на правую боковую грань и преломляясь на ней, свет проходит сквозь линзу 7, которая собирает параллельные пучки света в своей фокальной плоскости. Тут размещена линейка фотодетекторов 8, на которой формируется изображение светлой полосы с резким переходом к темноте. Край светлой полосы соответствует свету, распространяющемуся в рецепторном чипе 1 под предельным углом. Если чип поворачивать, то край светлой полосы перемещается вдоль линейки фотодетекторов 8. Сигналы от нее поступают на регулятор 9, который управляет работой узла микроперемещения 6. Перемещение происходит до тех пор, пока граница между светом и темнотой на линейке фотодетекторов 8 не попадет в заведомо заданную точку. Это положение чипа фиксируется. Теперь чувствительная поверхность чипа точно сориентирована под нужным углом. Точность ориентации определяется размером отдельного фотодетектора и фокусным расстоянием линзы и может быть вычислена по формуле (23.2). Например, при = 5 мкм и = 40 мм будем иметь точность ориентации приблизительно 0,007 , что обеспечивает довольно высокую чувствительность сенсора.

Для проведения анализа корпус прибора закрывают непрозрачной крышкой и включают источник поляризованного света, который состоит из светодиода или полупроводникового лазера 10 и поляризатора 11. Расходящийся в пределах 3 ..5 пучок поляризованного света 12 проходит сквозь левую грань рецепторного чипа, падает под нужным углом на чувствительную поверхность 2 и, отразившись от нее, выходит через правую грань чипа и направляется к линейке фотодетекторов 13. С нее снимаются сигналы распределения интенсивности отраженного света по углам отражения (кривая ППР).

Автоматическая угловая ориентация рецепторного чипа в такой схеме (за несколько секунд) позволяет сократить время проведения анализов до минимума. Процесс измерений можно организовать следующим образом: оператор имеет с собой нужное количество готовых для анализа рецепторных чипов. На каждый из них он наносит исследуемые пробы жидкости (например, молока). Когда истекает интервал времени, требуемый для взаимодействия чувствительной поверхности с аналитом, оператор устанавливает соответствующий рецепторный чип в прибор. В нем автоматически выполняются точная угловая ориентация, измерение кривой ППР, обработка и выдача результатов на индикатор. После этого оператор вынимает рецепторный чип с исследованной пробой и вместо него устанавливает в прибор следующий рецепторный чип, уже "созревший" для анализа. Тогда производительность ППР сенсора может составить сотни анализов/час.

Еще одним важным вопросом является взаимозаменяемость съемных рецепторных чипов. Ведь резонансный угол ППР зависит не только от концентрации аналита, но и от свойств самого рецепторного чипа. В связи с этим исследовано влияние этих параметров и предложены такие технологические режимы изготовления рецепторных чипов, при которых последние становятся с достаточной точностью взаимно заменяемыми. К тому же возможность использования каждого рецепторного чипа должна проверяться в лабораториях после его регенерации перед выдачей на повторное использование.