В работе используется импульсный флуориметр WaterPAM (Walz, Германия). Watеr-PAM служит для измерения различных параметров флуоресценции и их световых зависимостей. Процедура измерения фотохимического и нефотохимического тушения флуоресценции на флуорометре приведена на рисунке 3. Сначала измеряется уровень Fo у выдержанного в темноте образца при открытых реакционных центрах. Затем подается один импульс насыщающего света 0,8 с, который закрывает реакционные центры и убирает фотохимическое тушение. При этом режиме регистрируют максимальную флуоресценцию Fm. Эти два уровня задают максимальную величину переменной флуоресценции Fv = Fm - Fo. Через некоторый интервал времени включается постоянный действующий свет, который индуцирует изменения выхода флуоресценции, характерные для обычной индукционной кривой флуоресценции хлорофилла F(t). При этом на всем протяжении индукционной кривой переменная величина F(t) остается меньше, чем Fm. Разница между Fm и F(t) характеризует общее тушение флуоресценции, которое развивается под действием постоянного света. Общее тушение складывается из фотохимического и нефотохимического тушения. Во время действия насыщающей вспышки фотохимическое тушение снимается, и флуоресценция возрастает до значения Fm'. Однако, значение Fm' остается меньше, чем Fm. Так как в обоих случаях фотохимическое тушение отсутствует, разница между (Fm-Fm') характеризует величину нефотохимического тушения, индуцированного постоянным освещением. Соответственно, разница (Fm' – F(t)) характеризует величину фотохимического тушения и пропорциональна количеству фотосинтетически активных центров ФС2 на этом свету.
Рис. 3. Принцип регистрации разных параметров флуоресценции, в том числе величин фотохимического (qP) и нефотохимического тушений (qN, NPQ) при постоянном освещении на флуориметре. Fo и Fm – постоянная и максимальная флуоресценция у адаптированного к темноте листа при одиночном освещении односекундным импульсом мощного белого света; Fo' и Fm' – постоянная и максимальная флуоресценция после продолжительного освещения; Ft – квазистационарный уровень флуоресценции у адаптированного к свету листа; Светлые стрелки–включение и выключение измеряющего модулированного света, жирные темные стрелки – соответственно начало и конец непрерывного освещения, тонкие темные соответствует коротким вспышкам света насыщающей интенсивности.
На свету проводятся измерения быстрых световых зависимостей различных параметров флуоресценции при последовательном увеличении интенсивности от 0 до 900 мкЕ/(м2с). Протокол измерения световых кривых показан на рисунке 4.
Рис. 4. Принцип регистрации световой кривой флуоресценции на флуориметре Water-PAM.
Время освещения при каждой интенсивности составляет 30 секунд. При таких временах освещения быстрые переходные процессы, связанные с изменением интенсивности, заканчиваются и световые зависимости близки к таковым, регистрируемым при длительном стационарном освещении. В конце каждого сеанса освещения измеряется выход флуоресценции хлорофилла F(t), а также параметры Fm' с использованием насыщающей вспышки (0.8 с, 2000 мкЕ/(м2с). На основании всех параметров определяется квантовый выход фотохимического превращения поглощенной световой энергии в ФС 2 как отношение Y= (Fm'-Ft)/Fm', нефотохимическое тушение флуоресценции NPQ=(Fm-Fm')/Fm и относительная скорость нециклического электронного транспорта при данной интенсивности света (rETR). Скорость транспорта электронов рассчитывается по формуле rETR = Y·Ei, где Ei – освещенность, мкЕ/(м2с). На основании полученных световых кривых оценивают следующие фотосинтетические параметры: коэффициент максимальной утилизации световой энергии (угол наклона световых кривой, α), максимальную относительную скорость электронов по электрон транспортной цепи (rETRmax) и насыщающую интенсивность света (Ен). α рассчитывают как коэффициент линейной регрессии, построенной по точкам, лежащим на светолимитированном участке световых кривой, rETRmax – как среднее по значениям rETR, находящимся на светонасыщающем участке. Ен рассчитывают по формуле Ен = rETRmax / α. Обозначения и определения фотосинтетических параметров приведены в соответствии с общепринятой номенклатурой.
