Большинство веществ, входящих в состав промышленных и бытовых стоков, способны оказывать токсическое действие на микроводоросли. В связи с этим водорослевые биотесты входят в число основных при нормировании качества вод: «Руководство по определению методом биотестирования токсичности вод, донных отложений, загрязняющих веществ и буровых растворов», Минприроды РФ, 2002; «Методика определения токсичности проб поверхностных пресных, грунтовых, питьевых, сточных вод, водных вытяжек из почвы, осадков сточных вод и отходов по изменению оптической плотности культуры водоросли хлорелла (Chlorella vulgaris Beijer) » / Ю.С. Григорьев // ПНД Ф Т 14,1:2:4,10-04, М.2004; «Методика определения токсичности вод, водных вытяжек из почв, осадков сточных вод и отходов по изменению уровня флуоресценции хлорофилла и численности клеток водорослей. » ФР.1.39.2007.03223. / Н.С.Жмур, Т.Л. Орлова // М., «Акварос»2007.
В современной практике широко используются стандартизированные методы биотестирования на пресноводных зеленых микроводорослях рода Chlorella и Scenedesmus, культивируемых по общепринятой методике. Основными показателями токсического действия служат рост и выживаемость культуры. Между тем оценка токсичности вод и в особенности питьевой воды по реакции фотосинтетического биотеста с использованием флуоресценции является чрезвычайно актуальна. Флуориметры позволяют регистрировать параметры флуоресценции хлорофилла культур водорослей для быстрого обнаружения в водной среде токсических веществ. Преимущества использования флуоресценции связаны с быстротой (2 мин), низкой трудоемкостью процесса измерения, а так же с ее высокой чувствительностью к действию токсикантов, поскольку она отражает состояние фотосинтетического аппарата водорослей, являющегося мишенью для многих веществ. Регистрация на свету первичных изменений фотосинтетического аппарата, наиболее чувствительного к повреждающим воздействиям, позволяет сократить время инкубации до 1-3 часов, по сравнению с 1-10 сутками при оценке токсичности по снижению скорости роста. Испытания метода на ряде модельных токсикантов (ионы Cu, Hg, Cd, Cr, Zn, гербициды и др.) показали, что чувствительность его находится на уровне ПДК для этих веществ. С использованием этого метода возможно проведение исследования детоксицирующих свойств гуминовых веществ различного генезиса по отношению к тяжелым металлам, гербицидам и ПАУ. Методика выполнения измерений обеспечивает выполнение измерений с низкой погрешностью. Учитывая кратковременность экспериментов и предусмотренную методикой возможность жесткого контроля за условиями проведения опытов, разброс измеряемых параметров в повторах относительно низкий.
Материалы нанотехнологии уже сегодня получили широкое применение в производстве товаров широкого потребления, технике и медицине. На сегодняшний день насчитывается более 2300 видов продукции с применением наноматериалов и мировое производство интенсивно растет. Наноматериалы используются в производстве пластиков, катализаторов, аккумуляторов и электродов топливных элементов, систем очистки воды, ортопедических имплантов, проводящих покрытий и компонентов электроники. Увеличение производства приведет к увеличению их выброса в окружающую среду. При этом наночастицы и наноматериалы обладают комплексом физических, химических свойств и биологическим действием, которые часто радикально отличаются от свойств этого же вещества в форме сплошных фаз или макроскопических дисперсий.
Поэтому, чрезвычайно важным является оценка экологических последствий их влияния на экосистемы. Это отражено в специальных постановлениях утвержденных Гл.санврачем РФ -«Методические рекомендации по выявлению наноматериалов, представляющих потенциальную опасность для здоровья человека.» МР 1.2.2522-09, М, 2009 г. ; «Токсиколого-гигиеническая оценка безопасности наноматериалов. Методические указания» МУ 1.2.2520-09 М., 2009 г.
Применение флуоресценции водорослей в качестве биосенсоров, по-видимому, может быть с успехом использовано для тестирования наноматериалов. В последнее время появилось несколько работ по влиянию наночастиц на водоросли. Многие наночастицы делаются с содержанием различных металлов, в том числе и тяжелых металлов. Соли тяжелых металлов занимают особое положение среди загрязнений внешней среды, что связано с их высокой токсичностью, способностью накапливаться в организмах и передаваться по трофической цепи. Тяжелые металлы, попадая в водоемы, оказывают токсическое действие на фитопланктон, который является первичным звеном в системе пищевых связей водных организмов и определяет состояние водной экосистемы в целом. Среди метаболических процессов внутри растительной клетки наиболее чувствительным к действию тяжелых металлов является фотосинтез. Исследования показывают, что по флуоресценции водорослей возможно обнаруживать разные токсичные загрязнители и особенно соли тяжелых металлов, при достаточно низких концентрациях. Соответственно, этот подход, может быть легко использован для наноматериалов, содержащих металлы.
Цель данной задачи – освоение методов флуоресцентного анализа на примере исследования токсического действия наноматериалов (наночастиц серебра) на микроводоросли с использованием метода регистрации световых и индукционных параметров флуоресценции хлорофилла.
Объекты исследования: В экспериментах используются культуры пресноводных одноклеточных зеленых водорослей Chlorella pyrenoidosa и Chlamydomonas reinhardtii.
Методы: флуоресцентные методы анализа состояния фотосинтетических организмов (световые кривые и индукционные кривые флуоресценции(JIP-тест).
План работы:
1) Установка рабочей концентрации водорослей в суспензии по сигналу Ft для работы в оптимальном диапазоне чувствительности приборов. Определение отношения Fv/Fm для контрольного образца для подтверждения его высокой фотосинтетической активности.
2) Разлитьсуспензию водорослей в колбы объемом 50 мл. Одну колбу оставить в качестве контрольного образца. В другие колбы добавить исследуемые наночастицы в нужных концентрациях .
3) Провести инкубацию водорослей с наноматериалами в камере для культивирования и измерить параметры флуоресценции через 1, 4, 8 часов и сутки.
4) Записать данные и напечатать черновые рисунки по световым и индукционным кривым с программ для приборов.
5) Построить графики по световым зависимостям параметров флуоресцеции (Ft, Fm’, Yield, qN, NPQ, rETR) и рассчитать параметры световой кривой относительной скорости нециклического электронного транспорта (коэффициент максимальной утилизации световой энергии (угол наклона световых кривой, α), максимальную относительную скорость электронов по электрон транспортной цепи (rETRmax) и насыщающую интенсивность света (Ен).
6) Построить и рассчитать параметры индукционных кривых флуоресценции ( расчет по JIP-тесту).
7) Применение различных программных пакетов для обработки полученных результатов.
