Важной характеристикой кювет является пропускание светового потока стенками кюветы, это зависит от материала, из которого изготовлена кювета.
Кюветы из обычного стекла не рекомендуют использовать даже в ближнем ультрафиолете, то есть при 340 нм из-за сильного поглощения стекла в этой области спектра. Для работы в дальнем ультрафиолете рекомендуется использовать флуоритовые кюветы, которые прозрачны для длин волн 125 – 200 нм. Кюветы из обычного боросиликатного стекла подходят для измерений в видимой и ближней УФ частях спектра. Для работы в более коротковолновой области (меньше 300 нм) требуются кюветы из кварца.
В клинической биохимии принято использовать прямоугольные кюветы с плоскопараллельными стенками и длиной оптического пути 1 см. Прямоугольные кюветы практически не изменяют направление светового потока и незначительные перемещения такой кюветы в световом потоке не приводят к существенным ошибкам измерения.
В спектрофотометрах и современных фотометрах широко применяются прямоугольные кюветы из полистирола макротипа (размер 10 × 10 × 45 мм), в которых измерение ведется в объеме около 1 мл, и полумикрокюветах (рисунок 104) размером 10 × 4 × 45 мм, объем реакционной смеси около 0,5 мл. В микрокюветах луч проходит по узкому каналу шириной до 2 мм то же расстояние в 10 мм, как в макрокюветах, поэтому луч должен быть узким. Для точной ориентации кювет требуются специальныедержатели.
Пластмассовые кюветы имеют хорошую прозрачность и в видимой, и УФ областях, но использование пластмассовых кювет наталкивается на проблемы обеспечения допусков, очистки, стойкости к воздействию растворителей, температурных деформаций.
Большинство пластмассовых кювет разработано для одноразового использования.
Созданы также фотометры, в которых фотометрирование проводиться в круглых пробирках. Фотометрическая ячейка таких фотометров сконструирована таким образом, что пробирка занимает всегда одно и тоже положение в световом потоке (центрируется).
В противном случае незначительные смещения пробирки от заданного положения могут привести к большим ошибкам, так как пробирка представляет собой цилиндрическую линзу. Другой источник ошибки – эллиптичность (отклонение от цилиндрической формы) пробирки. Устранить эту ошибку можно только экспериментальным путем. Нужно нанести маркер на одну какую-либо сторону пробирки и устанавливать в дальнейшем пробирку в фотометр только в одной и той же ориентации. Эллиптичность приводит к изменению стандартной оптической длины пробирки и это отклонение (систематическую ошибку) нужно определить с помощью стандартных растворов и учитывать в дальнейшем при обработке результатов. Конечно, этот метод пригоден только для ручных технологий работы на фотометрах.
Кроме прямоугольных кювет и пробирок в фотометрах с вертикальным фотометрированием применяются групповые кюветы – 8-ми и 12-ти луночные стрипы, планшеты из 96 лунок и 9-ти луночные блоки (рисунок 106). Планшеты бывают цельными и наборными из 8-12 стрипов.
Лунки в стрипах и планшетах имеют цилиндрическую форму небольшого диаметра, что приводит к возникновению мениска жидкости. Вогнутый мениск подобен рассеивающей линзе, выпуклый – собирающей линзе. Наличие мениска сферической формы предъявляет строгие требования к позиционированию лунки в оптическом канале фотометра. Для компенсации влияния мениска донья лунок иногда делают сферической формы, а световой луч возможно тоньше и фокусируют его на поверхность мениска на оси симметрии.
Кюветы должны быть чистыми и оптически прозрачными. Разводы или налет на
стенках, очевидно, изменят величину поглощения. Стеклянные кюветы, используемые в видимом диапазоне, очищаются обильным ополаскивающим водопроводной и дистиллированной водой. Щелочные растворы не должны оставаться в кюветах длительное время, так как щелочь медленно растворяет стекло, что приводит к разводам.
Кюветы могут очищаться в умеренном моющем средстве или ополаскиваться сконцентрированной смесью HC1 : вода : этанол (1:3:4). Кюветы никогда не нужно ополаскивать цветными очищающими растворами, так как растворы имеют тенденцию адсорбироваться на поверхности и изменять цвет стекла.
Кюветы, используемые для измерений в УФ области спектра должны обрабатываться с особой тщательностью. Невидимые царапины, отпечатки пальцев или остаточные следы ранее измеренных растворов могут значительно повлиять на поглощение. Хороший способ проверки кювет заключается в том, что все используемые кюветы заполняются дистиллированной водой, затем измеряется поглощение каждой кюветы против бланка. Эта величина, по существу, должна быть равна нулю.
В настоящее время в некоторых фотометрах используются проточные кюветы. В этих кюветах реакционная смесь через помпу подается в узкий канал, в котором производится измерение оптической плотности. Стандартная проточная кювета имеет внутренний объем (в котором производится непосредственно измерение) ~30 мкл. В проточных кюветах последующая проба вымывает из кюветы предыдущую пробу. Для того чтобы не было эффекта переноса при последовательном измерении разных проб (надежно промывалась кювета), рекомендуется пропускать через кювету не менее 10- кратного объема по сравнению с измерительным объемом, то есть не менее 300 мкл.
Уменьшение объема реакционной кюветы имеет ограничения. При ручном дозировании даже с использованием автоматизированных пипеток нежелательно работать с объемами менее 8 – 10 мкл, так как при таком дозировании существенно увеличивается ошибка, связанная с объемом биопробы. Особенно сильно этот фактор влияет при дозировании вязких растворов. Как правило в клинической химии используются соотношение объем биопробы/объем рабочего реактива в диапазоне 1 : 10 - 1 : 200. Поэтому наиболее распространенными являются измерительные кюветы с объемом около 1 мл.
В биохимических автоанализаторах используются реакционные кюветы с малым объемом до 100 мкл. При этом дозирование осуществляется с диапазоном в 0,1 мкл. Для этого используются специальные гамильтоновские шприцевые дозаторы и стандартная процедура дозирования. Кроме того, применяются схемы дозирования с разделением в наконечнике воздушной пробкой объемов биопробы и рабочего реактива и вымывание из наконечника биопробы дополнительным объемом растворителя.
