Вещества, способные изменять (вращать) плоскость поляризации света, являются оптически активными веществами; вещества, не способные изменять плоскость поляризации света являются оптически неактивными.
Поляриметрический метод анализа основан на измерении угла вращения плоскости поляризации луча света, прошедшего через оптически активную среду, которая помещается между поляризатором и анализатором. Оптическая активность веществ обуславливается двумя факторами: а) особенностью кристаллической решетки вещества и б) особенностями строения молекулы вещества.
Первой особенностью обладают твердые вещества – кристаллы, например, кварц, хлорид натрия и другие.
Вторая особенность свойственна многим растворам, главным образом, органических веществ: глюкозы, винной кислоты, морфина и другим.
Если поместить мутный раствор в кювету фотометрического прибора, то световой поток, проходя через кювету, будет поглощаться (если раствор окрашен), частично проходить через кювету, не изменяя направления (трансмиссия), частично рассеиваться, изменяя свое направление, отклоняясь под различными углами (рассеивание). Трансмиссия и рассеяние света зависят от длины волны светового потока, его частоты, интенсивности, а также от свойства рассеивающей среды: размера частиц, их формы, количества, способности к поляризации и др. Если в процессе измерения размер частиц в растворе будет меняться (например, в результате взаимодействия антиген-антитело), то будет соответственно меняться поток проходящего и интенсивность рассеянного света.
Характер (тип) рассеивания зависит от соотношения длины волны света и диаметра частицы, на которой происходит рассеивание.
Рассеивание света каждой частицей не зависит друг от друга, рассеянный свет распространяется во всехнаправлениях, однако максимальное количество света рассеивается под углом 0 и 180 градусов к лучу, падающему на частицу. При длине волны 400 нм такой тип рассеивания будет характерен для частиц диаметром менее 40 нм. К таким частицам в плазме крови относятся многие плазменные белки, в том числе иммуноглобулины, в.липопротеиды, альбумин и т.д. При увеличении размеров частиц рассеивание становится несимметричным и максимальное количество света рассеивается в направлении падающего луча.
Сравнивая величины рассеянного и падающего света Ir и Io можно определять концентрацию веществ в растворе. Такой метод исследования называется нефелометрией, а приборы, на которых производят измерения – нефелометрами.
Измерение светорассеивания под разными углами (как правило, используются измерение малоуглового рассеивания) дает информацию о размерах частиц в растворе. В то же время, если известны размеры частиц рассеивающего вещества, то возможно по интенсивности рассеянного света при фиксированном угле измерения определить концентрацию вещества. Методы, основанные на взаимодействии антиген-антитело, высоко специфичны, поэтому практически во всех случаях известно, что измеряется. Исходя из этого, приборы для нефелометрии, как правило, программируются под измерение определенных специфических компонентов биологической жидкости, чаще всего индивидуальных белков.
Свет от лампы разделяется на 2 пучка – один пучок проходит через раствор исследуемого вещества, другой через канал сравнения. В окуляре видны 2 поля – одно измерительного канала, второе – канала сравнения. Изменяя ширину щели, добиваются равной освещенности полей.
Результат получают по калибровочным кривым, связывающим ширину щели и концентрацию вещества. В последнее время в нефелометрах вместо обычных ламп используют лазерные источники излучения. Лазер имеет высокую интенсивность излучения, строгую направленность излучения и строго фиксированную длину волны излучения, что делает лазерный луч идеальным для нефелометрических измерений.
