Процесс образования, дифференцировки и созревания форменных элементов крови из клеток-предшественниц в условиях специфического микроокружения называется гемопоэзом. Последовательность развития кроветворения в эмбриональном периоде характеризуется, прежде всего, сменой локализации гемопоэза: желточный мешок – печень – красный костный мозг. В связи с этим у эмбриона и плода последовательно и с частичным перекрыванием по времени возникновения и затухания различают мегалобластическую стадию (начинается на 3-й неделе в желточном мешке, заканчивается на 12 неделе), гепатоспленотимическую стадию (в печени кроветворение начинается на 5–6 неделе развития, а к концу 5‑го месяца интенсивность гемопоэза в печени уменьшается; гемопоэз в селезёнке наиболее выражен с 4 по 8 месяц внутриутробного развития; в вилочковой железе первые лимфоциты появляются на 7–8 неделе) и костномозговое кроветворение (кроветворение в костном мозге начинается в течение 5-го месяца развития, а к 7-му месяцу костный мозг становится главным органом гемопоэза).
В постнатальном онтогенезе кроветворение осуществляется главным образом в костном мозге губчатого вещества плоских костей (прежде всего, кости таза, грудина, тела позвонков, череп, ребра) и эпифизов длинных трубчатых костей (проксимальные отделы костей бедра, голени, плеча). Образование клеток происходит в костно-мозговых балках, вне сосудистых синусов (рисунок 1).
В норме в кровоток поступают только зрелые элементы, для чего они должны преодолеть барьер в виде промежутков между эндотелиальными клетками костномозговых синусов. Этот процесс регулируется селезенкой и нервной системой. Раздражение симпатической нервной системы стимулирует созревание и выход клеток в кровь, раздражение парасимпатической нервной системы, напротив, тормозит эти механизмы.
Когда костный мозг не в состоянии удовлетворить повышенный и длительный запрос на образование клеток крови, гемопоэтическая активность печени, селезёнки и лимфатических узлов может восстановиться (экстрамедуллярный гемопоэз).
Помимо кроветворения в костном мозге, как в селезёнке и печени, происходит удаление из кровотока старых и дефектных клеток крови (гемодиерез).
Согласно современной схеме кроветворения, авторами которой являются И.Л.Чертков и А.И.Воробьев (1973 г.), все кроветворные клетки в зависимости от их зрелости и морфологических особенностей разделены на 6 классов
Родоначальными клетками всех ростков кроветворения являются клетки 1 класса - стволовые клетки (полипотентные).Термин «стволовая клетка» (СК) был введен российским гистологом А.А.Максимовым в 1909 г. на съезде гематологического общества в Берлине. Стволовой эти клетки были названы по аналогии с деревом, из которого растут и развиваются все его ветви. Стволовая клетка называется CFU-blast (CFU — Colony Forming Unit, колониеобразующая единица).
В середине 60-х годов ХХ века российские ученые А.Я.Фриденштейн и И.Л.Чертков заложили основы науки о СК красного костного мозга. В костном мозге имеются гемопоэтические (кроветворные) и стромальные (мезехимальные) СК. Гемопоэтические СК формируют все типы клеток крови, а также могут дифференцироваться в клетки головного мозга, печени, сосудов. Стромальные клетки способны дифференцироваться в клетки хрящевой, костной, мышечной, жировой тканей, ткани печени и кожи (рисунок 3). Причем способность к таким превращениям у них сохраняется и при выращивании колонии из одной единственной клетки. Стромальные СК костного мозга представляют собой более сложные и долгоживущие системы, которые, однако, обновляются достаточно редко. Стромальные клетки в небольшом количестве находятся в различных органах и тканях, постоянно циркулируют в кровотоке.
В ходе онтогенеза количество стромальных клеток уменьшается. Так, у новорожденных в костном мозге на 10000 СК приходится 1 стромальная клетка. В подростковом возрасте их уже в 10 раз меньше. К 50-ти годам на 500000 кроветворных СК - 1 стромальная, а в 70 лет 1 стромальная клетка приходится на 1000000 гемопоэтических клеток.
До сих пор не удалось создать метод прямого выявления СК. В настоящее время существует только один исключительно оперативный метод определения СК, основанный на ее способности восстанавливать и поддерживать всю жизнь кроветворение в смертельно облученном организме. Понятно, что такой метод осуществим только в эксперименте на животных. Для выявления СК человека приходится определять их как клетки, способные репопулировать кроветворную систему иммунодефицитных мышей (линия scid/nod). Именно в эксперименте на животных было установлено, что популяция СК состоит из двух подотделов. Первый составляют клетки, способные восстановить мультилинейное кроветворение, продолжающееся в течение всей жизни - длительно репопулирующие клетки. Собственно только эти клетки являются истинными СК. Во второй подотдел входят клетки, также способные к мультилинейной дифференцировке, однако продолжительность их жизни относительно невелика – коротко репопулирующие клетки.
Таким образом, отдел СК отличается значительной гетерогенностью, так как обнаружены клетки с различным пролиферативным потенциалом и полипотентностью (таблица 1).
Таблица 1. Характеристика отдела стволовых мультипотентных клеток
Название клетки
Общая характеристика
Примитивная стволовая кроветворная клетка
(пСКК или pHSC)
Способна восстанавливать нормальное кроветворение у облученных, поэтому их называют – клетки, репопулирующие (восстанавливающие) костный мозг – КРКМ или MRC (Marrow Repopularing Cell). Даже одна такая клетка способна поддерживать кроветворение у реципиента. Обнаружены в эмбриональной печени.
Клетка, обеспечивающая поддержание кроветво-рения в длительной культуре костного мозга – КИДК или LTC-IC (Long-term Culture Initiating Cell)
Эти клетки способны поддерживать процессы кроветворения в культуре не менее 5-7 недель.
Клетки, образующие области булыжника – КООБ или CAFC (Cobblestone Area Forming Cell):
КООБ 5
КООБ 2 или КОЕ-с12 или CFU-c12 (Colony Forming Unit Cell)
КОЕ-с8
Более зрелые полипотентные предшественники. Такое наименование получили потому, что под микроскопом напоминают булыжную мостовую. Эти клетки в зависи-мости от степени зрелости и способности образовывать колонии делятся на КООБ 5, КОЕ-с12, КОЕ-с8.
Наиболее ранние из этих предшественников требуют для образования областей «булыжников» от 5 до 8 недель. Содержание этих клеток в 10 раз выше, чем пСКК.
Эта клетка образует «булыжник» в культуре за 10-12 дней и идентична клетке, образующей колонии в селезенке через 12 дней после трансплантации костного мозга облученным мышам. Поэтому КООБ2 получила название КОЕ-с12 или CFU-c12.
Более зрелый предшественник, способный образовывать колонии в селезенке за 7-8 дней после трансплантации
Морфологические характеристики СК крайне невыразительны, что объясняется незрелостью клеток, а внешне выражается в высоком ядерно-цитоплазматическом отношении, гомогенности хроматина и отсутствии четких признаков дифференцировки. Морфологически эти клетки выглядят как недифференцированные бласты или малые лимфоциты с тонкой структурой хроматина
Наиболее надежный критерий идентификации СК – иммуноморфологический. Стволовая кроветворная клетка экспрессирует характерный комплекс маркёров, которые позволяют выделить её из пуповинной крови и плаценты, костного мозга, периферической крови. Такими маркёрами являются CD34, CD31, CD59, Sca-1, Thy1, Oct-4, Nanog, SOX2, FGF4.
Основные свойства СК:
ü длительное самоподдержание своей линии;
ü быстрая трансформация и пролиферация;
ü дифференциация во всех направлениях гемопоэза.
В отделе СК, число которых в кроветворной ткани менее 1%, осуществляется качественная регуляция кроветворения. Причем основная масса СК находится вне клеточного цикла, в стадии G0. Лишь 10-20 % СК пролиферирует. При выходе из состояния покоя СК вступает на путь дифференцировки, постепенно снижая свою способность к размножению и тем самым ограничивая набор дифференцировок. В большинстве случаев этот процесс непрерывен, однако некоторые СК после проделывания 1-3 делений вновь возвращаются в состояние покоя. Однако это состояние покоя менее глубоко, и при наличии запроса СК способны ответить на него значительно быстрее, приобретая маркеры дифференцировки в культуральной среде за 1-2 дня, тогда как исходные СК требуют для этого 10-14 дней.
Итак, относительный покой — определяющая характеристика СК, тогда как её потомки обладают высокой пролиферативной активностью. Из одной начинающей дифференцировку СК может образовываться около 1 млн. зрелых эритроидных клеток и 100 тыс. гранулоцитов и макрофагов.
Однако процесс дифференцировки СК в сторону того или иного ростка кроветворения окончательно не выяснен. Существуют две основные модели механизма комитирования СК. Согласно стохастической модели кроветворенияпроцесс комитирования происходит случайно, не зависит от внешних воздействий и не определяется потребностью организма в данный момент в клетках той или иной линии дифференцировки. Детерминистическая модель основана на том, что выбор направления дифференцировки осуществляется с внешним запросом на клетки соответствующего вида. Доказано, что на СКК в минимальных количествах экспрессированы рецепторы основных цитокинов. В зависимости от концентрации определенного цитокина происходит выбор дальнейшей судьбы СК.
Согласно концепции костномозговых ниш в кроветворной ткани существуют специализированные образования, в которых СК находятся в заторможенном состоянии и не реагируют на воздействия внешних стимулов. После покидания ниши СК попадают под влияние гемопоэтических факторов и начинают дифференцироваться. Согласно данной гипотезе выход СК из ниш случаен, а кроветворные клетки развиваются в постоянном взаимовлиянии с мезенхимальными (стромальными) клетками и остеобластами. Вступление СК в клеточный цикл регулируется молекулярным «переключателем» — ингибитором циклин-зависимой киназыp21cip1/waf1 (p21). При делении СК дочерние клетки выбирают симметричное или асимметричное деление, т.е. или остаются СК, или дифференцируются в полипотентные потомки с их последующей дифференцировкой в клетки крови, или подвергаются апоптозу.
СК способны выходить из костного мозга в общий кровоток. На 4000 лимфоцитов в периферической крови приходится 1 СК. Не исключена возможность поступления СК в кровеносное русло из селезенки. В системном кровотоке процессы кроветворения осуществляться не могут, так как для этого необходимо специальное микроокружение, подобное тому, что есть в костном мозге. Гемопоэзиндуцирующее окружение играет решающее значение в регуляции кроветворения и выполняет роль локальной регуляторной системы. Представлено оно клетками стромы (фибробласты, жировые клетки, эндотелиальные клетки), Т-лимфоцитами, моноцитами, макрофагами, выделяющими цитокины, которые влияют на процессы кроветворения и обеспечивают развитие клеток:
фактор стволовых клеток или белковый фактор стила (steel – стальной);
лейкозингибирующий фактор;
интерлейкины 1, 3, 6, 11, 12;
гранулоцитарный колониестимулирующий фактор.
Кроме цитокинов и ростовых факторов для развития и дифференцировки клеток-предшественников требуется их плотная адгезия с окружением с помощью особого белка - фибронектина. Фибронектин связывает клетки-предшественники с помощью особых рецепторов с поверхностью фибробластов и эндотелиальных клеток. Если такой адгезии нет, то пролиферация и дифференцировка клеток ингибируется.
Запомните! 1. В красном костном мозге существует отдел стволовых полипотентных клеток-предшественников, которые закладываются только в эмбриогенезе и расходуются последовательно, образуя сменяющие друг друга клеточные клоны. СК способны дифференцироваться по всем направлениям миело- и лимфопоэза. 2. Стволовая клетка иммунокомпетентна и способна образовывать клетки иммунного ответа. 3. Основные характеристики стволовых клеток:
· Тотипотентность — способность образовывать любую ткань организма.
· Хоуминг — способность стволовых клеток, при введении их в организм, находить зону повреждения и фиксироваться там, исполняя утраченную функцию.
· Факторы, определяющие уникальность стволовых клеток, находятся в цитоплазме, а не в ядре. Это избыток мРНК 3 тысяч генов, которые отвечают за раннее развитие зародыша.
· Теломеразная активность.
Клетки 2 класса – частично детерминированные полипотентные клетки – предшественницы. Это более зрелые клетки-предшественницы, которые могут тормозить пролиферацию СК и имеют более ограниченные возможности к самоподдержанию (3-4 недели). Этот класс представлен олигополипотентными коммитированными клетками, дающими начало полипотентным колониеобразующим единицам (КОЕ).
1. Клетка, образующая в культуре колонии бластных клеток– КОЕбл или CFUbl (Colony Forming Unit blasts). В культуре тканей продуцируют строго определенный клон клеток. За 3 - 4 недели образуют небольшие колонии, состоящие из 300 - 400 недифференцированных бластов. Обладают наибольшим пролиферативным потенциалом из клеток этого класса.
2. Колониеобразующая единица высокого пролиферативного потенциала - КОЕ-ВПП или HPP-CFC (High Proliferatife Potential Colony Forming Cell). Эта клетка дает до 1-2 мм в диаметре колонии макрофагов, полипотентна и способна к реклонированию.
3. Клетка, дающая смешанные колонии:
А). Полипотенциальные клетки-предшественники:
· КОЕ гранулоцитарно–эритроцитарно-макрофагально-мегакарио-цитарные (КОЕ-ГЭММ) клетка способна дифференцироваться по 6 направлениям миелопоэза. На КОЕ-ГЭММ оказывает влияние интерлейкин-3 и гранулоцитарный колониестимулирующий фактор;
Б). Бипотенциальные клетки-предшественники:
· КОЕ-ГМ (способны дифференцироваться в нейтрофилы и моноциты);
· ККЕ-ГЭ (способны дифференцироваться в нейтрофилы и эритроциты);
· КОЕ-МЭ (способны дифференцироваться в мегакариоциты и эритроциты);
· КОЕ-ТБ (способны дифференцироваться в базофилы и тучные клетки);
· КОЕ-ЭОЭ (способны дифференцироваться в эозинофилы и эритроциты)
Существование общей клетки предшественницы лимфопоэза Т- и В –лимфоцитов до сих пор не подтверждено.
Запомните! 1. В процессе созревания кроветворная клетка не обязательно последовательно проходит все возможные стадии созревания: она может сразу же превратиться в монопотентный предшественник, без стадии олигополипотентного. Более того, не исключено, что и примитивная стволовая клетка не проходит всех стадий дифференцировки и может в зависимости от запроса пропускать многие из них. 2. Пролиферация клеток 2 класса регулируется ростовыми факторами, секреция которых зависит от существующего запроса, т.е. представляет собой уже не стохастический, а детермининрованный процесс. 3. В отдел клеток 2 класса входят преимущественно клетки-предшественницы миелопоэза (CFU-GEMM) и лимфопоэза (CFU‑Ly), потомки которых остаются полипотентными или дифференцируются в один из нескольких типов коммитированных унипотентных клеток (колониеобразующих единиц), также активно пролиферирующих, но дифференцирующихся обычно только в одном направлении.
3 класс – унипотентные (монопотентные) коммитированные клетки-предшественницы. Эти клетки не способны к длительному самоподдержанию, однако доля пролиферирующих клеток в этом классе самая высокая: 60-100% клеток находятся в состоянии пролиферации. В данном отделе осуществляется основная количественная регуляция кроветворения, таким образом, клетки 3 класса обеспечивают организм необходимым количеством форменных элементов нужного вида в зависимости от его конкретных потребностей, запросов. Эти клетки способны дифференцироваться только в направлении одного ростка и дают начало морфологически распознаваемым клонам. К ним относятся:
5. Унипотентные клетки предшественницы красного ряда:
а) БОЕ-Э (бурстобразующая единица эритроцитов, взрывообразующая единица эритропоэза - BFU-E = Burst Forming Unit–E), происходящая из CFU-GEMM (полипотентной клетки–предшественницы миелопоэза), чувствительны к интерлейкину 3, мало чувствительны к эритропоэтину. Выделяют:
· БОЕ-Э незрелая (примитивная) обладает очень низкой чувствительностью к эритропоэтину, дает большие колонии в культуре (десятки тысяч клеток), продуцирует фетальный гемоглобин HB-F.
· БОЕ-Э зрелая – более чувствительна к эритропоэтину, чем БОЭ-незрелая, образует мелкие колонии (тысячи клеток), продуцирует HB-A и HB-F.
б) КОЕ-Э (колониеобразующая единица эритроцитов, CFU-E). Это более зрелая клетка- предшественница, чем бурстообразующие единицы, поэтому она чувствительна к эритропоэтину, образует мелкие колонии (50-100), продуцирует HB-A и только 1% HB-F.
На дальнейших стадиях эритропоэза из CFU-E дифференцируются эритробласты, пронормоциты, нормоциты, ретикулоциты и эритроциты.
Регуляция кроветворения на этом уровне осуществляется нервно-гуморальными факторами, которые могут оказывать как активирующее, так и тормозящее влияние на эритропоэз.
